Anonim

Temaer

  • imprinting
  • Molecular neuroscience
  • Bevegelsesforstyrrelser

Abstrakt

I nevropatologisk forskning anses inducerte pluripotente stamceller (iPSC) -deriverte nevroner som et verktøy som ligner på pasientens hjerne. Selv om det gjelder epigenetikk, har dette konseptet blitt utfordret. Vi genererte iPSC-avledede kortikale nevroner fra myoklonus-dystoniapasienter med mutasjoner (W100G og R102X) i det maternelt påtrykte ε-sarkoglykan-genet (SGCE ) og analyserte egenskaper som imprinting, mRNA og proteinuttrykk. Sammenligning av promotoren under omprogrammering og differensiering viste vev-uavhengig differensiell metylering. DNA-sekvensering med metyleringsspesifikke primere og cDNA-analyse i pasientneuroner indikerte selektiv ekspresjon av den muterte paternal SGCE- allelen. Mens fibroblaster kun uttrykte den allestedsnærværende mRNA-isoformen, ble hjerne-spesifikk SGCE mRNA og e-sarkoglykanprotein detektert i iPSC-avledede kontrollneuroner. Imidlertid ble nerveproteinivåer redusert i begge mutanter. Vår fenotypiske karakterisering fremhever egnetheten til iPSC-avledede kortikale nevroner med SGCE- mutasjoner for myoklonus- dystoniforskning og på mer generelle grunner ber om bruk av iPSC-avledede cellemodeller for å studere epigenetiske mekanismer som påvirker helse og sykdom.

Introduksjon

Inducert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi har i stor grad avansert vår forståelse av veier underliggende nevrologiske lidelser 1, 2 . Nyere arbeid foreslo epigenetiske variasjoner mellom forskjellige iPSC linjer fra samme individ og til og med mellom ulike passasjer i en identisk klon 3, noe som tviler på anvendelighet og reproduserbarhet av metoden. Derfor er det av stor betydning å undersøke bruken av iPSC-teknologien for å studere spesifikke epigenetiske relaterte nevrologiske sykdommer som myoklonusdystoni (MD).

MD er en alkohol-responsiv begynnende bevegelsesforstyrrelse. Pasientene lider vanligvis av myokloniske jerks i nakken, trunk og overlempene, samt dystoni. Etablerte diagnostiske kriterier klassifiserer pasienter som "mulig", "sannsynlig" og "bestemt" MD. Mer enn 75% av de klinisk "definitive" tilfellene har mutasjoner i SGCE 4 .

SGCE- assosiert MD er arvet på en autosomalt dominant måte med variabel uttrykksevne og ufullstendig penetrering 5 . Sistnevnte er forårsaket av materiell imprinting, et epigenetisk fenomen som resulterer i selektiv silencing av moderens SGCE allel 6, 7, et funn som er av translasjonell relevans da det spesifikt informerer genetisk rådgivning av mutasjonsbærere.

Proteinet kodet av SGCE, dvs. e-sarkoglykan, tilhører en familie av transmembrane proteiner. En hjerne-spesifikk isoform av SGCE, som inkluderer en ekstra ekson, dvs. exon 11b, er overveiende uttrykt i hjernebarken, cerebellum og hippocampus 8 .

Mens wildtype-e-sarkoglykan lokaliseres til plasmamembranet, ble alle analysemetoden for misensmutsmutantene som ble analysert, beholdt intracellulært og nedbrytet av proteasomet i overekspresjonsstudier ved bruk av pattedyrcellelinjer 9 .

Her undersøker vi for første gang potensialet for iPSC-avledede nevroner fra MD-pasienter som en menneskelig cellulær sykdomsmodell for å studere de molekylære konsekvensene av endogene SGCE- mutasjoner, med særlig vekt på fenomenet materiell imprinting av SGCE- genet.

resultater

iPSCs fra MD-pasienter med SGCE- mutasjoner er effektivt differensiert til kortikale nevroner

Vi genererte iPSC kolonier fra fibroblaster av en pasient med W100G SGCE og fra en pasient som husker den vanligste SGCE mutasjonen - R102X 10 . Immunofluorescensanalyse indikerte høye nivåer av endogene pluripotensmarkører OCT4, Tra-1-60, NANOG og SSEA-4 i pasientens iPSC-linjer (figur 1A). Karyotypen av begge linjene var normal (figur 1B) og kvantitativ RT-PCR-analyse viste effektiv siling av de virale transgene OCT4, SOX2, cMYC og KLF4 sammenlignet med nylig infiserte fibroblaster (figur 1C). I samsvar med immunfluorescens-resultatene indikerte mRNA-ekspresjonsanalyse høye nivåer av pluripotensmarkørene NANOG, GDF3, OCT4 og SOX2 i begge pasient-iPSC-linjer sammenlignet med ikke-transfekterte fibroblaster (figur 1D). Sammenligning av ekspressjon av AFP, GATA4 og SOX17 (endoderm), RUNX1, MSX1 og MYH6 (mesoderm) samt NCAM, PAX6 og NES (ectoderm) ved kvantitativ RT-PCR av belagte embryoidlegemer og de respektive iPSCs bekreftet potensialet for iPSCs å avvike i alle tre kimlagene (figur 1E). Fra disse resultatene konkluderte vi med at MD-pasientfibroblastene var velprogrammert til iPSCs.

( A ) Immunofluorescensdeteksjon av pluripotensmarkører SSEA-4, NANOG, Tra-1-60 og OCT4 i iPSC-kolonier fra begge MD-pasienter. ( B ) Karyotype analyse av iPSC klonene fra begge pasientene. ( C ) Residual ekspressionsnivåer av transgenene OCT4, SOX2, cMYC og KLF4 (i forhold til ACTB ) anvendt for retroviral omprogrammering. Verdier ble normalisert for respektive ekspressionsnivåer i infiserte fibroblaster (isolert 7 dager etter infeksjon). Feilbarene angir SD. ( D ) Relativ genuttrykk av pluripotensmarkørene NANOG, GDF3, OCT4 og SOX2 i fibroblaster og iPSCs. ACTB fungerte som housekeeping gen. Ekspresjonsnivåer av fibroblaster ble satt til 1. ( E ) Relativ genuttrykk av AFP, GATA4 og SOX17 (endoderm), RUNX1, MSX1 og MYH6 (mesoderm) samt NCAM, PAX6 og NES (ectoderm), som representerer alle tre kimen lagene . ACTB servert som housekeeping gen og spontant differentierte embryoidlegemer av iPSCs ble sammenlignet med den respektive iPSC-linjen. ( F ) Immunofluorescensanalyse av nevronmarkøren TUJ1 (rød) og de kortikale markørene Tbr1 (blå) og Brn2 (grønn) (øvre bilde) og DAPI (hvitt) (lavere bilde) i iPSC-avledede pasientneuroner.

Full størrelse bilde

I lys av overveiende SGCE- ekspresjon i cortex 8, ble SGCE- mutant- og kontroll-iPSCs differensiert til kortikale nevroner. Immunofluorescensanalyse indikerte at ca. en tredjedel av cellene som er positive for neuronal markør TUJ1, uttrykker også Tbr1 (som lokaliseres til de kortikale lagene I, II / III, Vb, VI og subplate) eller Brn2 (som er tilstede i kortikale lag I, II / III og Vb) 11 (figur 1F).

Differensiell metylering av SGCE- promotoren i kontroll og MD-pasient-iPSC og iPSC-avledede nevroner

Deretter undersøkte vi virkningen av omprogrammerings- og differensieringsprosedyren på metyleringsstatusen til SGCE- promotoren. For dette ble DNA ekstrahert fra blod, fibroblaster, iPSCs og iPSC-avledede nevroner av et sunt individ. Sanger-sekvensering etter bisulfittbehandling (som medierer omdannelsen av alle ikke-metylerte cytosiner til uracilrester som senere ser ut som thyminer) avslørte differensielt metylerte CpG-dinukleotider i alle undersøkte kontroll-DNA-prøver (figur 2A). Det samme eksperiment ble utført med DNA fra MD-pasientneuronkulturer. Denne analysen bekreftet differensiell metylering ved alle de 25 CpG-repeteringene som ble testet (data ikke vist).

Metyleringsmønsteret til SGCE- promotoren ble undersøkt ved DNA-sekvensering med metyleringsspesifikke primere etter bisulfittbehandling. Ved bisulfittbehandling omdannes u-metylerte cytosiner til uracil og vises derfor som tyminer i den resulterende sekvens. ( A ) Mulige sekvenseringsresultater og deres tolkning er illustrert i øverste panel. I det nedre panelet vises sekvenseringsresultater av DNA ekstrahert fra blod, fibroblaster, iPSCs og iPSC-avledede nevroner av et sunt individ. Differensiell metylering ble påvist i alle vev. ( B ) Metyleringsspesifikativ sekvensering av SGCE- promotorregionen i iPSC-neuroner av en kontroll og begge MD-pasienter viste nærværet av fullt metylert DNA sammen med fullstendig ummetylert DNA i prøver som representerer henholdsvis mor og paternal allel. Kontinuerlig metylering (dvs. ingen veksling av ikke-metylerte og metylerte CpG-øyer) ble påvist.

Full størrelse bilde

Videre angav en sekvenseringsmetode med metyleringsspesifikke primere anvendt på bisulfittbehandlet DNA ekstrahert fra kontroll (Cnt1) og MD-pasient (W100G og R102X) iPSC-avledede neuroner to forskjellige statuser av promotorområdet - dvs. (i) metylering av alle CpG-øyer langs hele lengden av det amplifiserte DNA-fragmentet eller (ii) ingen forekomst av DNA-metylering i det hele tatt. Områder med intermittent metylering ble ikke påvist ved vår tilnærming (figur 2B).

iPSC-avledede nevroner fra MD-pasienter og kontroller uttrykker den hjernespesifikke spleisvariant av SGCE

For å ytterligere karakterisere de iPSC-avledede nevronene fra MD-pasienter med SGCE- mutasjoner og kontroller, analyserte vi de to mest omfattende mRNA SGCE isoformene. Den utbredte hjernespesifikke isoformen (NM_001099400.1) kan skille seg fra den allestedsnærværende isoformen (NM_003919.2) ved tilstedeværelsen av alternativt spleiset exon 11b og fraværet av exon 8 (figur 3A) 12 .

( A ) Sequencejustering av allestedsnærværende isoformen (NM_003919.2) og den hjernespesifikke isoformen (NM_001099400.1). De to isoformene er forskjellige med hensyn til nærværet av exons 8 og 11b. ( B ) cDNA-sekvensering indikerer ekspresjon av den allestedsnærværende mRNA- SGCE- isoformen i fibroblaster og tilstedeværelsen av den allestedsnærværende samt hjernespesifikke isoformen (inkluderer exon 11b) i iPSC-avledede nevroner. ( C ) Gene-ekspresjonsanalyse i iPSC-avledede nevroner fra MD-pasienter og kontroller. Nivåene av hjernespesifikt SGCE- transkripsjon og nevronmarkør MAP2 ble bestemt i forhold til ekspresjonen av housekeeping-genene ACTB og HPRT1 . Fibroblaster fra to friske individer ble brukt som negative kontroller. Verdiene ble normalisert til nevronkontrollen (Cnt) 1. Feilbarene indikerer SE. ( D ) PEG10 ekspressjonsanalyse i iPSC-avledede nevroner fra MD-pasienter og kontroller. Nivåene av PEG10 ble bestemt i forhold til uttrykket av housekeeping gener ACTB og HPRT1 . Feilbarene angir SE. ( E ) Ekspresjon av R102X hjernespesifikke SGCE ved behandling med cykloheximid. Verdiene ble normalisert til nonsensmutanten uten behandling. Det nedre panelet avbilder cDNA-sekvensen ved forskjellige cykloheximidkonsentrasjoner. ( F ) SGCE- cDNA-sekvensering i blod og iPSC-avledede nevroner av missense-mutant MD-pasienten (W100G). Fraværet av maternal c.298T allel og selektivt uttrykk av fader c.298G allel var i samsvar med imprinting av moderens wildtype allel i pasientneuronene.

Full størrelse bilde

cDNA-sekvensering viste at mens den ubiquitøse SGCE- isoformen hersket i kontrollfibroblaster, ble en kombinasjon av allestedsnærværende og hjernespesifikke SGCE uttrykt i iPSC-avledede nevroner (figur 3B). Realtids-PCR-ekspresjonsanalyse med en primer i exon 11b støttet dette resultatet. Markert høyere nivåer av hjernespesifikke SGCE ble detektert i kontroll og W100G-mutante iPSC-avledede neuroner sammenlignet med nivåene i kontrollfibroblaster. I nevroner med R102X SGCE- nonsensmutasjonen ble imidlertid en drastisk reduksjon av hjernespesifikk SGCE- isoform observert. Vi oppnådde lignende SGCE- genuttrykksresultater uavhengig av hvilket housekeeping-gen ( ACTB eller HPRT1 ) ble brukt som referanse (figur 3C). Videre bekreftet kvantitativ RT-PCR analyse av markørgenet MAP2 den neuronale karakteren av de resulterende cellekulturer (figur 3C).

Reduserte nivåer av hjernespesifikt SGCE- transkripsjon i R102X-mutant pasientneuroner på grunn av nonsens-mediert mRNA-forfall

For det første, for å teste om den observerte reduksjonen i mRNA-nivåene i R102X-neuronene er spesifikk for hjernespesifikt SGCE- transkripsjon, kvantifiserte vi også uttrykket av Paternally Expressed Gene 10 (PEG10 ) i våre neuronprøver . Det maternelt imprintede PEG10- genet befinner seg i en hode-til-hode stilling med SGCE og deler aksjer med SGCE 13 . Vår kvantitative RT-PCR-analyse indikerte ingen uttømming av PEG10- mRNA i nevroner som inneholdt R102X-mutasjonen i SGCE (Fig. 3D).

Deretter undersøkte vi muligheten for nonsens-mediert mRNA-forfall (NMD) som årsak til lave SGCE- transkripsjonsnivåer i R102X-neuronene. Behandling av cellene med 0, 20 eller 100 μg / ml cykloheximid - en potent NMD-inhibitor T-mutasjon: implikasjoner ved Parkinsons sykdomspathogenese. Neurogenetics 8, 103-109 (2007). "Href = / articles / srep41156 # ref14 aria-label =" Referanse 14 "data-track = klikk data-spor-label = link> 14 - resulterte i økende mRNA konsentrasjoner av hjerne- spesifikke SGCE (figur 3E, øvre panel). Videre indikerte cDNA-sekvensering ved hver av de forskjellige cykloheximidkonsentrasjonstrinnene at den observerte effekten hovedsakelig skyldes forhøyet ekspresjon av nonsens-mutant paternal allelen etter NMD-inhibering (figur 3E, lavere panel).

Materiell imprinting av SGCE opprettholdes i iPSC-avledede MD pasientneuroner uavhengig av mutasjonstype

Studier av mRNA i de iPSC-avledede MD-pasientneuronene ga oss ytterligere ledetråder om SGCE- promotorens inntrykksstatus . Videre utnyttelse av uttrykksdata i R102X-neuronene, var drastisk reduserte SGCE- nivåer ikke bare bevis på nonsens-mediert forfall av mRNA kodet av mutantfaderallelen. Med tanke på det tidligere observerte all-of-none-metyleringsmønsteret for SGCE- promotoren, er redusert SGCE- uttrykk også et tegn på stabil imprinting av moderens wildtype-allel gjennom omprogrammerings- og differensieringsprosedyren til iPSCs.

Dette funnet støttes av cDNA-sekvensering av SGCE i missense- mutantneuronene . I tråd med materiell imprinting bekreftet vår analyse tilstedeværelsen av den paternal mutante c.298G allelen (kodende for en glycin i posisjon 100 av e-sarkoglykan) og fullstendig fravær av moder c.298T wildtype allel i missense-mutantneuronene (Fig. .3F).

Wildtype ε-sarcoglycan lokaliseres til plasmamembranen i iPSC-avledede nevroner

I overekspresjonsstudier har e-sarkoglykan tidligere blitt vist å lokalisere seg til plasmamembranen 9 . Vi var i stand til å replikere dette funnet ved transient transfektering av HEK 293FT-celler med en vektor-uttrykkende hjerne-spesifikk e-sarkoglykan-Myc-FLAG. I et fraksjoneringsforsøk ble effektiv separering av cytosolen fra plasmamembranen oppnådd ved differensial sentrifugering som indikert ved lokalisering av markørproteinene p-aktin og Flotilin-1 til de respektive fraksjoner (figur 4A). FLAG-merket ε-sarkoglykan ble selektivt identifisert i plasmamembranfraksjonen ved bruk av et anti-FLAG-antistoff så vel som et antistoff (esg2-1355) rettet mot den hjerneassosierte isoformen av e-sarkoglykan (figur 4A) som bekrefter spesifisiteten av sistnevnte antistoff. Følgelig påvises den endogene hjernespesifikke isoformen av proteinet i iPSC-avledede kontrollneuroner, men ikke i fibroblaster av et sunt individ (figur 4B). Fraksjoneringsforsøk med SH-SY5Y-celler og kontroll av iPSC-neuroner indikerte også at endogen human s-sarkoglykan lokaliseres til plasmamembranen (figur 4C, D).

( A ) Specificiteten av esg2-1355-antistoffet ble testet i HEK 293FT-celler overuttrykkende hjerne-spesifikk e-sarkoglykan med en Myc-FLAG-tag. I et fraksjonsforsøk ble e-sarkoglykan-Myc-FLAG selektivt detektert i membranfraksjonen uavhengig av antistoffet som ble anvendt (anti-FLAG eller esg2-1355). p-aktin tjente som cytosolisk markør, mens Flotilin-1 ble brukt til å identifisere membranfraksjonen. ( B ) Wildtype hjerne-spesifikk e-sarkoglykan var detekterbar i iPSC-avledede kontroll-kortikale nevroner, men ikke i fibroblaster ved bruk av esg2-1355. P-aktinproteinivåer ble brukt som en lastekontroll. ( C, D ) I SH-SY5Y-celler ( C ) og iPSC-avledede nevroner ( D ) var endogen wild-hjerne-spesifikk e-sarkoglykan lokalisert i membranfraksjonen. ( E ) Mens endogen hjerne-spesifikk e-sarkoglykan ble identifisert i to kontroll-iPSC-avledede nevronprøver, ble det ikke observert noe signal i celler fra R102X-nonsensmutanten (på grunn av nonsens-mediert mRNA-forfall). På samme måte var endogen W100G e-sarkoglykan ikke detekterbar i iPSC-avledede pasientneuroner. ( F ) Behandling med proteasominhibitoren MG132 reddet delvis W100G e-sarkoglykan i cellene.

Full størrelse bilde

W100G missens mutasjonen fremmer proteasomal nedbrytning av endogen e-sarkoglykan

Endelig undersøkte vi overflod av endogen hjerne-spesifikk e-sarkoglycan i iPSC-avledede nevroner fra MD-pasientene med henholdsvis R102X- og W100G-mutasjonene. For begge mutanter oppdaget vi ikke noe e-sarkoglykanprotein (figur 4E). For R102X er dette på linje med NMD av mRNA transkribert fra den muterte, paternal SGCE allelen. I tilfelle av W100G e-sarkoglykan antydet vi at fraværet av proteinet (til tross for høyt uttrykk ved mRNA-nivået) kan skyldes proteasomal nedbrytning som tidligere observert i heterologe celler 9, 15 . For å bevise denne antagelsen behandlet vi missens mutantneuroner med proteasominhibitoren MG123, noe som resulterte i en delvis gjenoppretting av overflaten av W100G-sarkoglykan. Derimot påvirket behandlingen ikke proteinnivåene av wildtype-e-sarkoglykan i kontroll-iPSC-neuroner (figur 4F). Viktig er at mangelen på e-sarkoglykanprotein i begge pasientprøver er ytterligere bevis for fullstendig inntrykk av moderens wildtype-allel av SGCE i iPSC-avledede nevroner.

Diskusjon

Målet med studien var å etablere iPSC-avledede kortikale nevroner fra pasienter med mutasjoner i det maternelt påtrykte gen SGCE som et egnet humant cellemodelsystem for MD og - som bevis for prinsippet - for andre nevrologiske sykdommer der epigenetisk mekanisme av imprinting spiller en viktig rolle. Faktisk har vi for første gang vist allel spesifikk metylering av promotorregionen av SGCE i iPSC-avledede nevroner fra friske kontroller og mutasjonspositive pasienter. SGCE- inntrykksmønstrene av kildefibrroblastlinjene holdes gjennom hele omprogrammerings- og differensieringsprosessen. I kontrollneuroner blir den hjerne-spesifikke isoformen av SGCE uttrykt og det endogene villtypeproteinet lokaliseres til plasmamembranen. Imidlertid, i nærvær av W100G missensmutasjonen, nedbrytes e-sarkoglykan intracellulært med involvering av proteasomsystemet. Derimot interfererer R102X-mutasjonen med SGCE -genuttrykk.

Tilkomsten av iPSC-teknologi i 2006 16 har revolusjonert forskning, spesielt i lidelser som påvirker hjernen. Til dags dato har over tusen studier blitt publisert ved hjelp av de originale eller tilpassede versjoner av protokollen av Takahashi og Yamanaka som gjør det mulig å konvertere somatiske celler til en pluripotent tilstand. De resulterende iPSCs kan omdirigeres til hvilken som helst ønsket celletype, inkludert kortikale nevroner 17, 18 .

Til tross for metodens enestående suksess, har det nylig blitt reist bekymringer vedrørende ikke-fysiologiske epigenetiske endringer som oppstår under omprogrammeringen, som kan forstyrre metyleringsstatusen for trykte gener 3 . Hypometylering som følge av gjentatt iPSC-passasje har blitt beskrevet for forskjellige steder 19, 20 . Til slutt kan tap av allelspesifikt genuttrykk føre til at fenotypene regnes som ikke er relatert til sykdommen under undersøkelse 3 . En tilnærming til å omgå eller minimere virkningen av epigenetiske variasjoner i iPSCs er å fokusere på "lokale" fenotyper som sikkert kan spores tilbake til en bestemt genmutasjon. SGCE- assosiert MD kan tjene som et eksempel på en modell som gjør det mulig å studere mekanismer med redusert penetrering som er et forskningsfelt som i dag får stor interesse.

Utvider våre tidligere resultater fra blod-DNA 7 viste vi nå at SGCE er maternelt inntrykket i iPSC-avledede nevroner fra MD-pasienter med SGCE- mutasjoner. Differensiell metylering av SGCE- promotorregionen sammen med fraværet av wildtype-SGCE- mRNA og / eller e-sarkoglykanprotein ga bevis for epigenetisk siling av maternal allelen i missense og nonsensmutante nevroner. I lys av en tidligere studie som demonstrerer materiell imprinting av SGCE gjennom den menneskelige hjerne 8, antar vi at iPSC-avledede MD-pasient-kortikale neuroner speiler den fysiologiske SGCE- metyleringsstatusen i cortexen.

Likevel, basert på neuroimaging, er SGCE- inntrykkets "all-of-none" -virkning blitt stilt spørsmålstegn. Ved bruk av positronemissionstomografi ble det funnet metabolske endringer i thalamus, pons og cortex av MD-pasienter, samt ikke-manifesterende individer med mutasjoner i SGCE allel 21 av moderen . For å utfordre disse divergerende hypotesene, vil det være interessant å studere SGCE- promotormetylering i iPSC-avledede nevroner fra klinisk upåvirket mutasjons-positive slektninger til pasienter i fremtiden.

SGCE mRNA-transkripsjoner spaltes på en vevsspesifikk måte. En isoform som inkluderer en ekstra ekson mellom eksonene 11 og 12, dvs. exon 11b, er overveiende uttrykt i hjernen med høyeste nivåer i motorcortex og somatosensory cortex 8 . Fremhevet trofastheten til vårt MD-modellsystem, oppdaget vi signifikant økte cDNA-konsentrasjoner av transkripsjoner som inneholder exon 11b i iPSC-avledede nevroner sammenlignet med fibroblaster. Videre styrking av disse resultatene identifiserte et antistoff rettet mot hjerne-spesifikk e-sarkoglykan proteinet i iPSC-avledede nevroner, men ikke i fibroblaster av kontroller.

Flertallet av MD-pasienter med en mutasjon i SGCE-portdeletasjoner, innsettinger eller nonsensendringer som resulterer i en for tidlig stoppkodon 10 . Som et eksempel på et slikt scenario, undersøkte vi iPSC-avledede nevroner fra en pasient som bærer R102X-mutasjonen. I disse cellene var mRNA-nivåene av SGCE exon 11b markert redusert impliserende nonsens-mediert forfall av de mutante transkripsjonene. Behandling av R102X-neuroner med NMD-hemmercykloheximidet bekreftet faktisk at mutasjonen induserer nedbrytning av SGCE- transkripsjoner. Videre er uttrykksanalyse av PEG10 - et gen som befinner seg i en hode til hodeposisjon med SGCE og som er under kontroll av samme promotor 13 - bekreftet at den observerte mRNA-nedreguleringen i de nonsensmutante nevronene ikke er en global fenomen, men i stedet begrenset til SGCE transkripsjoner. I tråd med NMD manglet endogent R102X e-sarkoglykanprotein like i pasientneuronene.

Overekspresjon av mus-wildtype eller H36P, H36R og L172Rε-sarkoglykan (tilsvarende henholdsvis human H60P, H60R og L196Rε-sarkoglykan) i neuronale humane cellelinjer viste at det normale protein lokaliseres til plasmamembranen og Golgi-apparatet, mens missense mutanter blir beholdt i endoplasmatisk retikulum (ER). Assistert av ubiquitinsystemet gjennomgår disse nylig syntetiserte misfoldede e-sarkoglykanformer retrotranslokasjon fra ER til proteasom 9 . Å ha tilgang til fibroblaster fra en MD-pasient med en missense-mutasjon, testet vi den cellulære overflaten og lokaliseringen av W100G e-sarkoglycan i iPSC-avledede kortikale nevroner og faktisk observerte fenotyper i tråd med de publiserte data for mus H36P, H36R og L172R ε -sarcoglycan. På det endogene nivået viste W100G-sarkoglykan seg å være et mål for proteasomal nedbrytning i cytosolen.

Samlet sett viste vår karakterisering av iPSC-avledede kortikale nevroner med mutasjoner i SGCE at disse cellene er en egnet modell som speiler det endogene miljøet i MD-pasienthjerne, spesielt når man fokuserer på konkrete molekylære aspekter av sykdomsmekanismen. Vi forutsier at fremtidige studier som bruker dette modellsystemet, vil bidra til en bedre forståelse av endogen e-sarkoglykanfunksjon, og vil generelt spore bruken av iPSC-avledede cellemodeller for å studere epigenetiske mekanismer som påvirker helse og sykdom.

metoder

Pasienter

Alle pasienter og kontrollpersoner ga informert samtykke, og etikkutvalget ved Universitetet i Lübeck godkjente studien. Videre ble alle metoder utført i samsvar med forsøksprotokollene godkjent av etikkutvalget ved Universitetet i Lübeck. Diagnosen av MD ble etablert basert på publiserte kriterier 10 . Detaljert demografisk og fenotypisk informasjon om pasientene (L-5007 og L-6074) er tidligere publisert 22 . To friske kontroller som inkluderte i studien var i alderen 33 og 59 år ved biopsi og tok ingen mutasjon i SGCE- genet.

Kultur av cellelinjer og iPSC-avledede neuroner

HEK 293FT-celler, SH-SY5Y-celler og humane dermale fibroblaster fra kontroller og to MD-pasienter med mutasjoner i SGCE (dvs. W100G og R102X) ble dyrket ved 37 ° C under en 5% CO2 fuktet atmosfære i DMEM tilsatt 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin. Generering av iPSCs ble utført som tidligere publisert 1 . Kortikal neuron differensiering ble tilpasset fra Shi et al . 18 . Kort sagt ble iPSCs plated som enkeltceller. Ved 95% konfluens ble differensiering initiert i neuralt differensieringsmedium suppleret med Dorsomorphin (1 uM), SB 431542 (10 uM) og Y-27632 (10 uM). Inntil dag tolv av differensiering, ble mediepreparatet gradvis forskjøvet fra neuralt differensieringsmedium til nevralt vedlikeholdsmedium (NMM) supplert med Dorsomorphine, SB 431542 og Y-27632. Fra dag 13 til 17 ble cellene dyrket i NMM-medium inneholdende FGF (FGF2, basisk fibroblastvekstfaktor, 20 ng / ml) og BDNF (hjerneavledet nevrotrofisk faktor, 20 ng / ml). Nevrale rosettene ble manuelt replisert på dag 18 i NMM med BDNF (20 ng / ml), GDNF (Glialcelle-avledet nevrotrofisk faktor, 20 ng / ml) og AA (askorbinsyre; 0, 2 mM). Mediet ble byttet hver andre dag frem til dag 27, inkludert en ekstra manuell rosett-replisering på dag 23. På dag 28 ble rosettene dissosiert ved bruk av accutase og belagt ved ønskede tettheter i NMM (med BDNF, GDNF og AA). Inntil dag 43 ble mediet (NMM med BDNF, GDNF og AA) endret hver tredje dag. For endelig endring ble cellene dyrket i NMM.

Inhibering av NMD ble oppnådd ved sykloheximidbehandling i 8 timer ved 20 ug / ml og 100 ug / ml sluttkonsentrasjon. Proteasominhibering ved MG132-behandling ble utført ved 10 μM sluttkonsentrasjon i 8 timer. For transient transfeksjon av hjernespesifikke SGCE i HEK 293FT-celler ble en pCMV6 Entry-vektor (OriGene Technologies, Inc. Rockville, USA) benyttet. Celler for immunofluorescens ble fikset i 4% formaldehyd i 15 minutter, permeabilisert med 0, 1% Triton X-100 og blokkert i 4% passende normalt serum.

Western blotting og immunofluorescence analyser

Western blotting og immunofluorescensanalyser ble utført som publisert 23 med følgende antistoffer: anti-OCT4 (Abcam, Cambridge, UK), anti-Tra-1-60 (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), anti-NANOG (Stemgent, Lexington, USA), anti-SSEA-4 (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), anti-TUJ1 (Covance Inc., Princeton, USA), anti-Tbr1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-Brn2 -E-sarkoglykan (esg2-1355, publisert antistoff mot den hjernespesifikke isoformen av proteinet) 24, anti-FLAG (Sigma Aldrich, St. Louis, USA), anti-Flotilin-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, USA ) og anti-p-aktin (Sigma Aldrich, St. Louis, USA).

RNA-ekstraksjon, sanntids-PCR-analyse og sekvensering

RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNAeasy-beskyttelsessettet (Qiagen, Venlo, Nederland). Komplementært DNA ble syntetisert med Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Kvantifisering ble utført på LC480 (Roche) systemet med Maxima SYBR Green / Fluorescein qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Bisulfitbehandling av DNA ble utført med Premium Bisulfite Kit (Diagenode, Liège, Belgia). DNA-sekvenser ble oppnådd ved Sanger-sekvensering på et ABI 3130XL-system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). For å teste om imprinting forekommer på en enkelt SGCE- allel, ble DNA ekstrahert fra kontroll- og pasientneuroner og behandlet med bisulfitt. Ved bruk av dette DNA ble metyleringsspesifikk amplifikasjon av promoterregionen av SGCE oppnådd ved primere som binder selektivt til regioner som inneholder flere CpG-øyer. De resulterende sekvensene representerer poolet nevronalt DNA anriket for enten nærvær eller fravær av metylerte steder. Alle primersekvenser finnes i tilleggstabellen S1.

Subcellulær fraksjonering

Cellpellets ble oppløst i en homogeniseringsbuffer (sukrose 250 mM, Hepes 10 mM, pH 7, 4) med anti-protease-cocktail ved 4 ° C. Lysis ble oppnådd med 30 slag gjennom en G22 nål og en 1 ml sprøyte. Gjennom påfølgende trinn med sentrifugering (10 min ved 1000 g og 10 min ved 10 000 g) ble hele celler, rusk og mitokondrier ekstrahert fra løsningen. Membranfraksjonen og cytosolen ble separert etter 3 timers sentrifugering ved 18.000 g 25 .

Tilleggsinformasjon

Hvordan å sitere denne artikkelen : Grütz, K. et al . Trofast SGCE påtrykker iPSC-avledede kortikale nevroner: En endogen cellulær modell av myoklonus-dystoni. Sci. Rep. 7, 41156; doi: 10, 1038 / srep41156 (2017).

Utgiverens notat: Springer Nature forblir nøytral med hensyn til jurisdiksjonelle krav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggstabell S1

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens