Anonim

Temaer

  • Vekstfaktor signalering
  • proteolyse

Abstrakt

Frigivelse av cytokiner, vekstfaktorer og andre livsvesentlige molekyler fra forløpere ved a-disintegrin-og-metalloproteaser (ADAM) reguleres med høy substratspecifikitet. Vi antydet at dette oppnås ved spaltningsregulerende intracellulære domene (ICD) -modifikasjoner av forløpene. Vi viser her at spaltnings-stimuli-induserte spesifikke ICD-modifikasjoner forårsaker strukturelle substratforandringer som forbedrer ektodomainfølsomheten av neuregulin-1 (NRG1, epidermal-vekstfaktor) eller CD44 (reseptor-tyrosinkinase (RTK) -receptor) til chymotrypsin / trypsin eller oppløselig ADAM. Denne inn-ut-signaloverføringen krevde substrat homodimerisering og ble forhindret ved spaltningsinhiberende ICD-mutasjoner. I kimærer kan regulering tildeles en utenlandsk ektodomain, noe som tyder på en felles høyereordens struktur. Vi forutsier at substratspesifikke protease-tilgjengelighetsregulering styrer utgivelsen av mange ADAM-underlag.

Introduksjon

Frigivelse av mange vekstfaktorer og cytokiner samt mange reseptorer og adhesjonsmolekyler fra forløper-transmembraneproteiner ved metalloproteaser (ectodomain cleavage) regulerer mange biologiske funksjoner ved frigjøring av viktige molekyler involvert i signaloverføring mellom celler, eller fra det ekstracellulære rommet til innsiden av cellen 1, 2 . Neuregulins forløper NRG1 og hyaluronanreseptoren CD44 er slike viktige eksempler på skjulmolekyler. Neuregulin er viktig for neuritt utvokst og myelinering samt for hjerteutvikling og funksjon 3, 4 . CD44 spiller en dobbel rolle i vekstregulering ved at den medierer kontaktinhibering i forbindelse med hyaluronan 5, 6, 7, men den kan også fremme vekst og metastase av tumorceller 8, 9, 10, 11, 12 . Feil oppregulert eller redusert ectodomain spaltning er forbundet med sykdommer (f.eks. Refs 13 og 14). Stram kontroll over spaltning er derfor svært viktig for organismen.

Ektodomain-spaltning reguleres hovedsakelig av intracellulære signalveier, hovedsakelig stimulert av G-proteinkoblet-reseptorer og RTK-aktivering av receptor-tyrosin-kinase, som involverer proteinkinase-C (PKC) isoformer 15, 16, 17 . Det utføres hovedsakelig av en av to ADAM metalloproteaser, ADAM10 eller ADAM17 (omtalt i ref. 1). Likevel, hvordan ectodomain spaltning er regulert og gjort substratsspesifikke og hvordan intracellulære signaler påvirker proteolyse på celleoverflaten, er fortsatt ukjente.

Det er rikelig bevis på at metalloproteaser reguleres på flere nivåer: transkripsjon, menneskehandel, posttranslasjonell modifikasjon ved fjerning av pro-domene, dimerisering, redoksregulerte strukturelle endringer i ektodomain, ekstracellulær interaksjon med metalloproteaseinhibitoren TIMP3 og C-terminal fosforylering ( Gjennomgått i refs 1 og 18, 19, 20, 21, 22. Intracellulær signalering kan indusere en åpen konformasjon av ADAM17 katalytisk domene som vist ved studier med tett bindende ADAM17 inhibitorer. Imidlertid overraskende er de intracellulære domene (ICD) ADAM17 eller ADAM10 kan fjernes uten konsekvenser for indusert spaltning 22, 23, 24 . Således har en klar molekylær forbindelse av hvordan intracellulær signalering påvirker den ekstracellulært lokaliserte proteaseaktiviteten og spaltning, hittil ikke blitt fastslått.

Ektodomain spaltning reguleres også på substratnivå, ved ICD-modifikasjon av substratet 15, 16, men det som regulerer disse modifikasjonene, er ukjent. NRG1 og CD44 er forhåndsforbundet med deres ADAM-enzymer i fravær eller nærvær av spaltningsstimulus / ICD-modifikasjoner, hvilket gjør at næringsregulering av ADAM til dets substrat er usannsynlig (vurdert i refs 1 og 25). Vi spurte derfor om spaltningsregulerende substrat-ICD-modifikasjoner kan gjøre det lydløse ADAM-substratinteraksjonsproduktive ved å indusere strukturelle substrat-ektodomain-endringer som tillater proteaseadgang.

Her viser vi at NRG1 og CD44 faktisk gjennomgår intracellulære signal-induserte og ICD-modifikasjonsavhengige strukturelle endringer av deres ektodomains som tillater ADAM protease tilgang. PKCδ-indusert ICD-fosforylering regulerer NRG1-protease tilgjengelighet, mens CD44 krever indusert ICD-dephosphorylering, som frigjør ICD-interaksjon med tumor suppressor merlin (NF2). Våre resultater identifiserer en ny mekanisme for regulert ectodomain spaltning som sannsynligvis vil være relevant for mange andre ADAM substrater, inkludert vekstfaktorer og cytokiner.

Resultater og diskusjon

Spesifikke intracellulære signalavhengige substratmodifikasjoner induserer konformasjonsendringer i substratets ectodomain, noe som resulterer i økt tilgang av protease

Fordi ICD av ADAM10 og ADAM17 kan slettes uten konsekvenser for indusert spaltning (se ovenfor og ref. 25), antydet vi at spesifikke substratprecursorprotein-ICD-modifikasjoner regulerer ectodomain-protease tilgjengelighet av substratet.

For å avdekke slike inducerbare strukturelle endringer, undersøkte vi strukturtilstanden for substrat ectodomains i nærvær eller fravær av spaltningsstimuli, ved bruk av tilgjengelighet til trypsin / chymotrypsin eller oppløselig ADAM katalytisk domene som en utlasting. Som substrater brukte vi dobbelt merkede molekyler transfektert inn i RPM-MC humane pankreaskarcinomceller (CD44) eller HEK-celler (NRG1). RPM-MC-celler uttrykker ikke CD44, noe som tillater å undersøke overuttrykt CD44 og dets mutanter uten forstyrrelse av andre endogene motstykker. Både NRG1 og CD44 båret N-terminale FLAG-koder; NRG1 og CD44 båret C-terminale c-myc-koder eller alternativt EGFP-koder i utvalgte tilfeller av NRG1-eksperimenter (se skjema i figurene 2A, 3A og 6A). Overflateekspresjon av konstruksjoner ble bekreftet etter transfeksjon ved FACS-deteksjon av N'terminal FLAG ectodomain-taggen og ved western blot-deteksjon av N'terminal FLAG eller C-terminal MYC-taggen (figur 1). For NRG1 var det ingen forskjell i overflateekspresjon om en C-terminal c-myc eller EGFP-tag ble brukt (data ikke vist). Overflatesekspresjonen vist her (figur 1) bekrefter resultater som tidligere er oppnådd ved FACS-analyse av transfekterte NRG1-uttrykkskonstruksjoner 16 . Vi testet regulert spaltning av endogen ADAM for transfektert CD44 eller NRG1 og også for endogen CD44 (Supplemental Fig. 1; MDA-MB-231 brystadeneokarcinomceller) og for endogent NRG1 som angitt i teksten nedenfor. Spaltning ble indusert av TPA eller angiotensin II (AngII, i HEK293T-celler som uttrykker angiotensin-II-type1-reseptoren). For CD44 valgte vi trypsin fordi det produserer bare ett kutt i nærheten av stedet for ADAM10 spaltning (skjematisk på figur 2A); Andre formodede trypsinsteder er tilsynelatende gjemt inne i CD44s tredimensjonale struktur (skjematisk i figur 2B). For NRG1 valgte vi chymotrypsin. Chymotrypsin kutter bare NRG1 én gang mellom F229 og Y230 (skjematisk i figur 3A) 26 . Alle formodede ADAM17 spaltningssteder rapportert er innenfor sekvensen 226 MASFYKHLGIEFME 239 som omgir chymotrypsinstedet. Hovedskåret in vivo er identisk med det ved chymotrypsin 27 . I disse forsøkene ble endogen ADAM-aktivitet blokkert av batimastat (eller GM6001), og y-sekretase ble hemmet av DAPT, for å utelukke hvilken som helst annen proteolyse (ved y-sekretase og påfølgende ICD-behandling) utover virkningen av trypsin, chymotrypsin eller oppløselig ADAM.

(A ) TPA behandling øker CD44 ectodomain trypsin følsomhet. ( B ) Skjematisk for putative trypsinsteder skjult inne CD44s tredimensjonale struktur. ( A ) Metalloproteaseinhibering ble brukt til å blokkere ADAM-aktivitet i CD44-transfekterte RPM-MC-celler (GM6001 (15 μM)); 6 timer etter at TPA-addisjonsceller ble probet med trypsin, lysert og spaltningsprodukter oppløst ved SDS PAGE og immunoblot. y-sekresaseinhibitor DAPT (5 uM) ble tilsatt til alle eksperimenter. Se skisse for trypsin klyvingssted og merkelokalisering. Vist er et representativt eksperiment av fire uavhengige eksperimenter som har blitt evaluert av densitometri; kolonnediagrammet viser middelverdier av relative nivåer ± SD fra fire uavhengige eksperimenter.

Full størrelse bilde

( A ) Angiotensin II øker sensitiviteten til NRG1-EGFP ectodomain-chymotrypsin. Sammenlign NRG1fl spaltningsnivåer under DMSO (øverste panel), eller TPA stimulerte forhold (nedre panel); se røde bokser. ( B ) TPA indusert økt chymotrypsin følsomhet for endogent NRG1 startende ved begrensningskonsentrasjonen av 10 μg / ml chymotrypsin. Sammenlign NRG1fl nivåer under DMSO (venstre panel), eller TPA stimulerte forhold (høyre panel). Det endogene NRGl-spaltningsfragmentet nedbrytes raskt ved behandling med TPA og chymotrypsin (høyre panel). Vi brukte ingen y-sekretaseinhibering i disse spesielle eksperimenter. ( A ) HEK-celler som stabilt uttrykker NRG1-EGFP ble behandlet med metalloproteaseinhibitorbatimastat (5 μM). 6 timer etter at TPA-addisjonsceller ble probet med chymotrypsin, lyserte og spaltningsprodukter oppløst ved SDS PAGE og immunoblot. y-sekresaseinhibitor DAPT (5 uM) ble tilsatt til alle eksperimenter; BACE-hemmer (BACE-IV 1 μM) i tillegg i NRG1-eksperimenter. Se skisse for trypsin klyvingssted og merkelokalisering. Vist er et representativt eksperiment av fire uavhengige eksperimenter som har blitt evaluert av densitometri; kolonnediagrammet viser middelverdier av relative nivåer ± SD fra fire uavhengige eksperimenter. ( B ) HEK-celletrykkende endogen NRG1 ble bare behandlet som i ( A ). Et ytterligere gjentatt eksperiment er vist i tilleggsbilde 1.

Full størrelse bilde

( A - C ) ICDer modulerer spaltning og protease tilgjengelighet av "utenlandske" ectodomains i kimærene av CD44 og NRG1. ( A ) NRG1E / CD44 (TM + ICD): CD44 ICD regulerer spalting av NRG1 ectodomain; effekt av CD44 ICD mutanter. Se skiss for konstruksjon av kimærer. ( B ) Induksert spaltning av NRG1E / CD44 (TM + ICD) hemmes av batimastat. ( C ) NRG1 wt og NRG1E / CD44 (TM + ICD) viser lignende protease tilgjengelighet. ( A, B ) NRG wt og NRG1E / CD44 (TM + ICD) kimæren ble uttrykt i HEK293T celler E = ectodomain, TM = transmembrane domene, ICD = intracellulært domene. Den kimære konstruksjonen og dens CD44 ICD-mutanter ble transfektert inn i RPM-MC-celler, og spaltning ved TPA ble analysert som i figur 2. V = vektorkontroll. Wt = villtype. Batimastat (10 uM) ble tilsatt 15 minutter før TPA. I (A) øvre panel ble solNRG1E-prøvene kjørt på en gel, men en tom bane uten prøve som separerte -TPA og + TPA ble fjernet. Prøver av midtre og nedre paneler ble løp på samme gel. Prøver av ( B ) ble også kjørt på en og samme gel, men flere baner som viste andre prøver ble fjernet. ( C ) Protease tilgjengelighetsregulering av TPA i nærvær av batimastat (10 uM) ble bestemt som i figur 1B. Kolonnediagrammer viser gjennomsnittlige verdier av relativ nivå av ectodomain spaltning ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.

Full størrelse bilde

HEK-celler ble ko-transfektert med et plasmid som koder for RFP og en av konstruksjonene som er oppført. Alle disse konstruksjonene hadde en N-terminal FLAG-tag og en C-terminal MyC-tag. Kulturene ble inkubert i nærvær av ADAM- og Gamma-sekretaseinhibering. Etter 24 timer ble en alikvot av hver kultur analysert ved FACS ved bruk av anti-FLAG antistoffer og Alexa-488-merkede sekundære antistoffer. For CD44wt og CD44KR-MT viser vi to representative FACS-plott (øverst til venstre) og for resten av konstruksjonene viser vi overflate-fluorescerende intensitetsverdier som bestemt av FACS (tabell kolonne 3). Disse plottene og verdiene indikerer tilstedeværelsen av ectodomain av alle studerte konstruksjoner på celleoverflaten. En annen alikvot av hver kultur ble tatt for lysis og Western blotting ved bruk av enten antistoffer mot den N-terminale FLAG eller C-terminale MYC-taggen. Blottene ble kvantifisert av Image J, intensiteten normalisert for actin. Western blot båndintensiteter normalisert for actin er vist i tabell kolonne 4 og normalisering av disse verdiene til respektive wt kontroller er vist i tabell kolonne 5 og også i kolonnediagrammet (øverst til høyre). Både MYC og FLAG data fra Western blots viser riktig uttrykk for alle studerte konstruksjoner.

Full størrelse bilde

Ektodomainen av CD44 vekt i TPA-stimulerte celler var faktisk mer sensitiv for trypsin sammenlignet med ikke-stimulerte celler (figur 2A). Mens for ikke-stimulerte celler reduserte 10 μg / ml trypsin det første svake trypsin spaltningsproduktet ved en gitt temperatur, reduserte TPA mengden trypsin som kreves for den samme effekt til mindre enn 5 μg / ml (figur 2A, sammenligne spor 7 og 8 med baner 5 og 6). Videre måtte kontrollstimulerte celler kreve minst 20 μg / ml trypsin for å nå et nivå av CD44-spaltning som var sammenlignbar med det som detektertes etter TPA-stimulering, og ved bruk av kun 10 μg / ml trypsin (figur 2A, sammenligner bane 8 og 11). Nedenfor vil vi vise at disse resultatene kan reproduseres ved hjelp av det oppløselige ADAM10 katalytiske domene (se figur 4B).

Ectodomains av CD44 wt eller uklarbar CD44 KR-Mt mutant viser forskjellig protease tilgjengelighet til trypsin ( A ) eller oppløselig ADAM10 ( B ). ( C ) Merlin regulerer trypsin tilgang til CD44 ectodomain. Konstitutivt aktiv Merlin S518A blokkerer trypsin tilgang til CD44 (høyre panel) sammenlignet med wt merlin (venstre panel). ( D ) NRG1-S286A reduserer NRG1 ectodomain tilgjengelighet til chymotrypsin. ( E ) PKCδ knockdown reduserer NRG1 ectodomain tilgjengelighet til chymotrypsin. ( A ) CD44 vekt og ukomplisert KR-Mt ble sammenlignet etter eksponering for økende trypsinkonsentrasjoner (37 ° C) i 1 time (øvre) og 3 timer (nedre panel). Boksede par angir konsentrasjon med største forskjeller mellom wt og KR-Mt. Betingelser og spaltningsdeteksjon som i figur 1. Relative nivåer av trypsin-spaltet CD44 vist som innsatser. Basert på størrelsen på enkeltspaltningsproduktet, reduseres trypsin i ectodomain-stammen regionen. 64 kDa-bånd representerer mest sannsynlig underglykosylert CD44. ( B ) Samme som ( A ), men med oppløselig ADAM10 (37 ° C, konsentrasjoner og ganger angitt). ( C ) RPM-MC-celler ble ko-transfektert med merket CD44 vekt og konstitutivt aktiv merlin (NF2-S518A). CD44fl og C-terminale spaltningsprodukter (se "spaltning" midtpanel) ble detektert som i figur 1. Merlinuttrykk ble detektert av merlin-antistoff (øvre panel). I ( C ) ble prøver utført på samme gel, men flere baner som viste andre prøveforhold ved bruk av forskjellige trypsinkonsentrasjoner ble fjernet. ( D ) HEK293T-celler ble transfektert med NRG1 wt eller NRG1S286A eller co-transfektert med NRG1 wt og PKCδ shRNA ( E ). Behandlinger som angitt. Chymotrypsin klyvning av full lengde molekyl ble kvantitert og normalisert for tubulin (se kolonnediagrammer). Kolonnediagrammer viser gjennomsnittlige verdier av relative nivåer ± SD fra tre uavhengige eksperimenter; ns = ikke-signifikant, *** p-verdi <0, 001, **** p-verdi <0, 0001. Eksempler på immunblokker se tilleggsbilde 2A, B. Andre statistiske sammenligninger ikke vist: (3D) DMSO vs TPA-behandlet NRG1wt: ikke signifikant ved 0, 18 og 20 μg / ml, men signifikant ved 22 μg / ml (p-verdi 0, 01) og 24 μg / ml chymotrypsin ( p-verdi 0, 0025). DMSO vs TPA-behandlet NRG1S286A: ikke-signifikant. (3E) DMSO vs TPA-behandlet NRG1wt pluss forvrengt shRNA: ikke signifikant ved 0, 18, 20 og 22 μg / ml, men signifikant ved 24 μg / ml chymotrypsin (p-verdi 0, 005). DMSO vs TPA-behandlet NRG1wt pluss PKCδ-shRNA: ikke-signifikant.

Full størrelse bilde

NRG1 ble også proteasefølsom ved cellestimulering med enten TPA (ikke vist) eller angiotensin II (AngII) (figur 3A). Full lengde NRG1 (NRG1fl) ble redusert ved AngII-behandling til et nivå på 20% og et tilsvarende nivå av spaltningsprodukt ble generert ved 20-22 μg / ml chymotrypsin, et nivå som ble nådd med 28 μg / ml i ikke-stimulerte celler ( Fig. 3A, sammenlign rutekassene i øvre og nedre panel og kolonnediagrammet, en kvantifisering av fire uavhengige eksperimenter er vist i kolonnediagrammet). Tilsvarende ble det oppdaget lignende induserte endringer av protease tilgjengelighet for endogent uttrykt NRG1 i HEK-celler stimulert med TPA (figur 3B og tilleggsbilde 2, bemerk forskjellen i inkubasjonstemperatur).

I sammendraget endrer spaltningsregulerende signaler substrat-ektodomainstruktur som bestemt av en endring i ectodomain-tilgjengelighet til proteaser med liten molekylvekt.

ICD modifikasjoner regulerer protease tilgjengelighet til CD44 og NRG1 ectodomains

TPA eller AngII forårsaker posttranslasjonelle ICD-modifikasjoner av NRG1- og CD44- og ICD-punktmutasjoner, hemmer inducert spaltning; f.eks. i bindingsdomene for spaltningsregulerende ERM / merlinproteiner i CD44 (CD44-KR-Mt og CD44-S291D) eller av NRG1-S286 eller S28916. Vi brukte de samme spaltningsinhiberende ICD-mutasjonene for å teste om de forhindret indusert regulering av protease tilgjengelighet. Ektodomain av CD44 wt var spontant mer trypsin-følsom enn den ikke-spaltbare CD44-KR-Mt mutanten (figur 4A). Forskjellen ble spesielt synlig ved en trypsinkonsentrasjon på 20 μg / ml (inkubering en time) eller 10 μg / ml (inkubasjon tre timer, se røde firkanter og relative nivåkvantifiseringer i immunblokkene). CD44 wt og mutanten CD44-KR-Mt var også forskjellig i tilgjengeligheten til oppløselig ADAM10 i en lignende grad som ved bruk av trypsin. Mens 5 μg / ml oppløselig ADAM10 katalytisk domene spaltet CD44 vekt i en 2-timers inkubasjon var mutant KR-MT resistent mot spaltning (figur 4B). I samsvar med våre resultater på mutasjon av CD44 S291 og dens relevans for bindingen av spaltningsregulerende ERM / merlinproteiner til CD44 ICD 28, ble inhibering av protease tilgjengelighet av CD44 wt ved overekspresjon av en konstitutivt aktiv merlinmutant (figur 4C; en kvantifisering av tre uavhengige eksperimenter er vist i kolonnediagrammet). Den dårlig spaltede ICD-mutanten NRG1S286A viste signifikant redusert chymotrypsin-spaltning ved 24 μg / ml sammenlignet med NRG1 vekt (figur 4D, se eksemplarisk immunblot i tilleggsbilde 3A). Nedregulering av PKCδ som avskriver TPA- eller AngII-indusert NRG1S286-fosforylering og hemmer NRG1-spaltning 16, blokkerte TPA-indusert protease-tilgjengeligheten av NRG1 nesten fullstendig (figur 4E, se eksemplarisk immunblot i tilleggsbilde 3B).

De observerte effektene var egentlig substrat og ICD-spesifikk: AngII, en stimulus som bare induserer spaltning av NRG1 (Fig. 3A, nedre panel, sammenligne banene 1 og 2), men ikke av CD44 (Fig. 5, sammenlign banene 1 og 2), forårsaket ikke protease tilgjengelighets endringer i CD44. Signifikante trypsin spaltningsprodukter hvor det ble generert ved 2, 5 μg / ml, skilte CD44 spaltningsprodukter imidlertid ikke mellom kontroll- og AngII-behandlede celler (figur 5, sammenligne bane 5 med 6 og 7 med 8). Dette resultatet støtter videre vår observasjon at spesifikk spaltning av begge substrater adresseres av forskjellige PKC isoformer 15, 16, 29, nemlig PKCδ i tilfelle NRG116 og en annen PKC isoform (ikke PKCδ) i tilfelle av CD44 som vist ved inhibitorstudier 29 .

( A ) Angiotensin II øker ikke trypsin tilgjengelighet til CD44. HEK293T-celler stabilt overuttrykkende angiotensin II-reseptor 1 ble transfektert med merket wt CD44, stimulert med 1 nM AngII i 2 timer, og trypsin spaltning ble analysert som i figur 2A.

Full størrelse bilde

I sammendraget er de oppdagede forskjellene i ektodomain-følsomhetene av CD44 (trypsin), NRG1 (chymotrypsin) og deres respektive mutanter svært tydelige for endringer i ektodomain-struktur som oppstår som respons på intracellulære signalinducerte ICD-modifikasjoner og tillater proteaseadgang ved metalloprotease-stedet ved hjelp av enten trypsin / chymotrypsin eller oppløselig ADAM (testet for ADAM10, den fysiologiske sheddasen av CD44).

Domeneutveksling mellom NRG1 og CD44: ICD-modifikasjon regulerer tilgangen til protease av heterolog ectodomain

NRG1 og CD44 ectodomains varierer vesentlig i aminosyresekvensen, men begge gjennomgår regulering av protease tilgjengelighet som foreslår tilsvarende sekundære / tertiære strukturer. For å teste om spesifikke ICD-medierte protease tilgjengelighetsregulering kunne tildeles en "fremmed" ektodomain, utførte vi ICD-bytteeksperimenter mellom NRG1 og CD44 (se skjematisk i figur 6A). For CD44 konstruerte vi også kimære NRG1E (ectodomain) / CD44 (TM + ICD) konstruksjoner med de relevante CD44 spaltningsregulerende ICD-mutasjoner. CD44 ICD i NRG1 (E) / CD44 (TM + ICD) gir faktisk TPA-avhengig spaltning på det "fremmede" NRG1 ectodomain, som indikert ved frigjøring av solNRG1E og av det C-terminale spaltningsproduktet NRG1-CD44ΔE (figur 6A, sammenlign banen 2 og 7). CD44-spaltningsinhiberende ICD-mutasjonene KR-Mt og S291D, i motsetning til den spaltningsaktiverende S291A-mutasjonen, hemmet frigjøring av det "fremmede" oppløselige NRG1 ectodomain (solNRG1E) (figur 6A, spor 5 og 10) til en samme grad som det gjorde for den "native" solCD44E i CD44 wt 29 ; av notat, uttrykksnivåer, ikke laster, varierte mellom mutantkonstruksjoner av ukjente grunner). CD44E / NRG1ICD-kimærene viste spaltningsregulering akkurat som NRG1 wt som bestemt ved påvisning av en NRG1 spesifikk inhiberingsprofil med PKC blokkere (data ikke vist). Spaltning kan også fortsatt blokkeres av metalloproteaseinhibitorbatimastat (vist for NRG1 / CD44-kimær i figur 6B). Endelig tildelte ICD-modifikasjoner også regulering av protease til en "fremmed" ektodomain. Sammenliknet med kontrollceller, økte TPA chymotrypsin klyvning av NRG1E / CD44 (TM + ICD) kimæren nesten like mye som av NRG1 wt (over en chymotrypsinkonsentrasjon på ca. 20 μg / ml) (figur 6C, sammenlignet med figur 3A ). Denne observasjonen er av særlig betydning for gyldigheten av vår nye modell for ektodomainprotease tilgjengelighet regulering.

Disse resultatene tyder på at tilgjengeligheten av substratets ectodomain er regulert av en høyere rekkefølge struktur. ADAM-avhengig spaltning forekommer ved definerte spaltningssteder (vurdert i refs 1, 30 og 31. Induced-endringer i ectodomain-strukturen sannsynlig eksponerer disse stedene og tillater proteasekatalytisk spaltetilgang til ADAM-spaltningsstedet.

"Signaloverføring" gjennom plasmamembranen krever substratdimerisering

Overføring av en konformasjonell endring gjennom plasmamembranen kan ikke oppnås ved single-pass transmembrane proteiner. Den intracellulære proteinkinasen av RTKs for eksempel aktiveres ved ligandinducert relativ posisjonering av individuelle underenheter i reseptor dimerer som respons på ligandbinding ("ute-i" signalering) (gjennomgått i ref. 32). Vi antydet at "innvendig ut "Signalering som gir tilgang til substratprotease vil også kreve dimerisering. Både NRG1 og CD44 danner homodimerer som kan utgjøre en vesentlig forutsetning for deres regulerte ectodomain spaltning 25 . Fordi CD44 dimerer stabiliseres av SS broer, migrerte en del av CD44 som dimer i en ikke-reduserende gel. Den uklasselige CD44 mutanten (KR-MT) gjorde imidlertid nesten ikke dimerisering i det hele tatt (figur 7, baner 2 og 3). TPA-inducerte ectodomain spaltningsprodukter over et lavt basalt nivå er detektert i CD44 wt, men bare knapt i tilfelle mutant KR-MT (figur 7, sammenligne bane 2 og 3 med bane 5 og 6), korrelert med trypsin tilgjengelighet reduksjon av CD44 KR-MT (figur 4A).

( A ) CD44-dimerer kunne detekteres på denaturerende SDS-PAGE-geler under ikke-reduserende betingelser 25 . Den uklare CD44 KR-MT mutanten dimeriserer bare minimalt. TPA påvirket ikke dimerisering, men forbedret TPA-indusert frigivelse av oppløselig CD44 ectodomain. CD44 wt eller dets KR-MT mutant ble transfektert inn i RPM-MC-celler og spaltning ved TPA ble analysert som i figur 2. ( A ) prøver ble kjørt på en gel, men den tomme bane mellom -TPA og + TPA ble fjernet. ( B ) Kolonnediagrammet viser middelverdier av relative nivåer av ectodomain-spaltning ± SD oppnådd ved oppløsning på å redusere geler fra tre uavhengige eksperimenter.

Full størrelse bilde

ADAM og substrat er allerede forhåndsassosiert på en stille måte i fravær av en spaltningsstimulus 25, 33, 34 ; f.eks. hakk eller CD44 med ADAM10, samt NRG1 med ADAM17. Nettsteder for interaksjon med visse utvalgte underlag i det såkalte membranproksimale domenet (og utenfor katalytisk spalt) er beskrevet for ADAM17 35 . I tilfelle Notch, tillater binding av liganden protease-virkning 36, en strukturell modulasjon utløst direkte gjennom ektodomain. Protease tilgjengelighetsregulering av substratets ectodomain ved intracellulær signalering krever en annen mekanisme. Det er teoretisk mulig at ADAM-Substrate heterodimerer kreves for regulering av protease tilgjengelighet. Imidlertid, basert på resultatene våre med kimære konstruksjoner og sletting av ADAM10 ICD, og ​​basert på behovet for dimerisering, postulerer vi ICD-modifikasjonsmidlet posisjonering av en substratdimerekjede i forhold til den andre i en homodimer (arbeid presentert her og i ref. 25). Dette kan utløse konformasjonsendringen av høyere ordningsstruktur som er nødvendig for å tillate tilgang av den katalytiske spalten til den forhåndsassosierte ADAM-proteasen til substratets ADAM-spaltningssted.

Dimer-avhengig signaloverføring over cellemembranen er ikke uten forrang i begge retninger "innvendig" (som her) og "ute-i". I tillegg til RTKs, taler integrinregulering til denne prosessen. Binding av ECM ligander til integrin heterodimerer forårsaker ICD-modifisering 37 . Omvendt synes interaksjon av integrin beta-kjeden ICD med talin å forstyrre den "stille tilstand" av heterodimeren, som initierer "innvendig" signalering 38 .

For å forstå nøyaktig hva som skjer med dimer under signaloverføring krever krystallisering av de to tilstandene, før og etter stimulering av ligand eller i vårt tilfelle ICD-modifikasjon. Slike eksperimenter løst aktiveringsmekanismen for RTK homodimerer eller heterodimerer. Ligandbinding skaper endret posisjonering av de to EGF-reseptor-underenheter over membranen, aktivering av deres ICD-proteinkinaseaktivitet (omtalt i refs 32, 39 og 40). Slike opplysninger er venter på ADAM-underlag og deres dimerer.

Sammenfattende, som hovedbudskapet i dette papiret, viser vi at stille samspill mellom metalloprotease og dets substrater omdannes til en aktiv tilstand ved å spalte regulatoriske ICD-modifikasjoner som induserer signaloverføring til substratets ectodomain slik at protease-tilgjengelighet er en prosess som krever substratdimerisering. Vi hypoteser at denne nye spaltningsreguleringsmekanismen strekker seg til mange ADAM-underlag som tillater kontrollert og spesifikk utgivelse av livsvesentlige regulatoriske molekyler som vekstfaktorer, cytokiner og dekoderreseptorer. Som sådan kan denne mekanismen være tilgjengelig for terapeutisk inngrep for å hemme virkningen av spesifikke metalloproteasesubstrater.

Eksperimentelle prosedyrer

Reagenser.

DNA-oligonukleotider [Metabion]; TPA, DAPT, angiotensin II, trypsin, chymotrypsin, TCA-DOC [Sigma]; beta-sekretase- (BACE) -inhibitor-I og batimastat (BB94) [Calbiochem]; GM6001, forbindelse E [Enzo]; oppløselig ADAM10 katalytisk domene og oppløselig NRG1 [R & D systemer]; DAPI [Vecta]. Lipofektamin 2000 [Invitrogen]; Fugene6, Komplett proteaseinhibitor cocktail [Roche].

Antistoffer.

Anti-FLAG (M2 og SIG1-25) [Sigma]; ADAM10 (735-749) og ADAM17 (TACE) (807-823) [Calbiochem eller R & D Systems]; et annet ADAM17 C-terminal antistoff var en gave fra Carl Blobel [Hospital for Special Surgery, New York]; c-Myc (9E10), HA (F-7), GFP (B-2), NF2 (merlin) (C-19; C-18; B-12); neuregulin-la / P1 / 2 (C20); og Actin (I-19) [Santa Cruz Biotechnology]; PKC δ (D10E2) og GFP (4B10 og D5.1) [Cell Signaling Technology]; a-Tubulin (ab4074) [Abcam].

Plasmider.

pcDNA3.1 [Invitrogen] -baserte plasmider som uttrykker cDNA som koder for CD44wt, NRG1wt eller merlinmutanten (NF2S518A og S518D) 7, 28 . Sekvensen som koder for standardisoformen av rotte CD44 ble subklonet inn i NotI / XbaI-stedene av pFLAG-myc-CMV-21, for å danne CD44 med N-terminale FLAG og C-terminale myc-epitoper. En retroviral konstruksjon som koder for FLAG-pro-NRG1-EGFP er blitt beskrevet 15 . CD44- og NRG1-ICD-mutanter samt ICD-mutanter av de kimære konstruksjonene ble generert ved stedrettet mutagenese; NRG1S286A var som i ref. 16. NRGE / CD44 (TM + ICD) ble generert ved subkloning av NRG1 ectodomain-sekvensen i pFLAG-myc-CMV-21 som inneholdt CD44 slik at CD44 ectodomain ble erstattet. CD44E / NRG (TM + ICD) ble generert på analog måte. Alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering.

Cellelinjer og transfeksjoner.

NIH3T3 fibroblaster var fra den europeiske samlingen av dyrcellekulturer [Salisbury, UK]. Den humane melanom RPM-MC-celler, negative for CD44, ble levert av Ivan Stamenkovic [University of Lausanne, Sveits], musembryonfibroblaster (MEF) med adam10- sletting av Paul Saftig [Kiel Universitet, Tyskland]. Stabil HEK-cellelinjer HEKNE WT og HEKNE NRG1S286A ble opprettet ved retroviral infeksjon med FLAG-NRG1β1a-EGFP (wt og S286A mutant) 16 . Alle celler ble dyrket i DMEM tilsatt 10% FBS. DNA- og siRNA-transfeksjoner ble utført i 6-brønnsplater (protease tilgjengelighetstudier) ved bruk av Lipofectamine 2000.

Inhibited Cleavage Conditions.

Metalloproteaseaktivitet ble blokkert ved å dyrke celler med bredspektrumhydroksamatbaserte metalloproteaseinhibitorer, 15 μM GM-6001 eller 5 μM batimastat (BB94) ved 15-30 minutter før TPA eller AngII-stimulering. I tillegg ble y-sekretaseaktiviteten blokkert av 5 uM DAPT eller ved 10 uM forbindelse E.

Begrenset proteolyse i dyrkede celler.

Celler ble podet i 6-brønnplater og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av trypsin for CD44 og chymotrypsin for NRG1 (i serumfritt medium) eller oppløselig rekombinant ADAM10 (i analysebuffer: 25 mM Tris pH 8, 0, 2, 5 μM ZnCl2, 0, 005% w / v Brij-35). Proteolyse ble stoppet ved tilsetning av 1x komplett proteaseinhibitor cocktail. Trypsin- og chymotrypsin-spaltningssteder ble bestemt ved bruk av PeptideCutter levert av ExPASy Bioinformatics Resource Portal.

Nedbør av proteiner ved TCA-DOC (Trichloreddiksyre - Na-deoksykolat).

Til påvisning av løselig CD44 ectodomain eller neuregulin ble celler dyrket i serumfritt medium. Kultursupernatanter ble forhånds-fjernet ved 10.000 rpm i 10 minutter, deretter blandet med 1/100 volum 2% DOC, vortexet og holdt på is i 30 minutter. Deretter ble 1/10 volum 100% TCA tilsatt, og prøvene ble holdt ved 4 ° C over natten. Bunnfallet ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 15 000 g i 15 minutter, skylles to ganger med aceton og gjenoppløst i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0, 5% natriumdeokoksolat, 0, 1% SDS).

Statistisk analyse.

For statistisk analyse ble intensiteten av bånd fra immunoblots kvantifisert ved hjelp av ImageJ og Image Lab ® (Biorad, Hercules, CA) -programvaren. Alle verdier i kolonnediagrammer er rapportert som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Statistiske analyser av eksperimenter ble utført ved hjelp av uparget Students to-tail t-test av data analysert fra minst tre til fire uavhengige eksperimenter.

Tilleggsinformasjon

Hvordan å sitere denne artikkelen : Parra, LM et al . Vekstfaktor og medreceptorutgivelse ved strukturell regulering av substratmetalloprotease tilgjengelighet. Sci. Rep. 6, 37464; doi: 10, 1038 / srep37464 (2016).

Utgiverens notat: Springer Nature forblir nøytral med hensyn til jurisdiksjonelle krav i publiserte kart og institusjonelle tilknytninger.

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Supplerende figurer og legender

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens