Anonim

Temaer

Abstrakt

Et ATM-avhengig cellesignal, en DNA-skaderespons, har vist seg å være involvert under infeksjon av human immunodefektvirus type 1 (HIV-1), og en høy forekomst av ondartet tumorutvikling har blitt observert i HIV-1- positive pasienter. Vpr, et tilbehørsgenprodukt av HIV-1, forsinker progresjonen av cellesyklusen i G2 / M-fasen, og ATR-Chk1-Wee-1, et annet DNA-skadesignal, er en foreslått cellulær vei som er ansvarlig for Vpr- indusert celle syklus arrestasjon. I denne studien presenterer vi bevis for at Vpr også aktiverer ATM, og induserer uttrykk for y- H2AX og fosforylering av Chk2. Påfallende, Vpr ble funnet å stimulere fokusdannelsen av Rad51 og BRCA1, som er involvert i reparasjon av DNA-dobbeltstrengspauser (DSB) ved homolog rekombination (HR), og biokjemisk analyse viste at Vpr dissocierer samspillet mellom p53 og Rad51 i kromatinfraksjonen, som observert under bestrålingsinducerte DSBer. Vpr ble konsekvent funnet å øke HR-frekvensen i stedet for I- Sce I, et sjeldent skjære-enzym-sted som hadde blitt introdusert i genomet. En økning av HR-frekvensen forsterket av Vpr ble dempet av en ATM-inhibitor, KU55933, som antyder at Vpr-induserte DSBer aktiverer ATM-avhengig cellesignal som forbedrer det intracellulære rekombinasjonspotensialet. I sammenheng med en nylig rapport som KU55933 dempet integrasjonen av HIV-1 i vertsgener, diskuterer vi den mulige rollen som Vpr-induserte DSBer i viral integrasjon og også i HIV-1-relatert malignitet.

Introduksjon

Induksjonen av en cellulær respons som ligner på DNA-skade-sensing-signaler har blitt vist under human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infeksjon (Daniel et al., 1999, 2003, 2004, 2005; Lau et al., 2004 ). Syntese av lineært HIV-1 DNA i cytoplasma ved revers transkripsjon og integrasjonsprosessen av HIV-1 DNA i vertsgenomet antas å være mulige utløsere for DNA-skade signaler (Lau et al., 2004, 2005). Når kromosomalt DNA er skadet (DSB; DNA-dobbeltstrengspause), aktiveres to typer kinaser (ATM og ATR) i utgangspunktet for å utøve kontrollpunktskontroll på cellesyklusen (Abraham, 2001). Når koffein, som er kjent for å hemme både ATR og ATM, administreres i forbindelse med virusinfeksjonen, blir integrasjonen av viralt DNA inn i vertsgenomet svekket (Daniel et al., 2005). I tillegg reduserte data som viste at den nylig utviklede ATM-inhibitoren KU55933 reduserte kopienummeret til de integrerte HIV-1-DNAene sterkt antyder at et ATM-avhengig signal har en sentral rolle i viraltransduksjon (Lau et al., 2005). I tillegg til mekanismen for virusinfeksjon, har HIV-1-induserte DSB eller deres signaler en innvirkning på den nærliggende AIDS-patogenesen, spesielt for kreftutvikling. En høy forekomst av ondartede svulster har blitt rapportert hos AIDS-pasienter (Mayer et al., 1995; Biggar et al., 1996; Straus, 2001), og nyere observasjoner har indikert at tumorutvikling observeres selv hos HIV-1-positive pasienter som ikke viser noen immunkompromitterte manifestasjoner (Knowles, 2003). Disse dataene antyder at HIV-1-infeksjon i seg selv er onkogen (Laurence og Astrin, 1991), men det virale protein som er ansvarlig for ATM-aktivering under HIV-1-infeksjon, har ikke blitt godt karakterisert.

Vpr, et tilbehørsgenprodukt av HIV-1, forringer utviklingen av cellesyklusen ved G2 / M-fase (He et al., 1995; Goh et al., 1998). Vpr antas å inaktivere Cdc2, som er en bestanddel av modningsfremmende faktor, ved fosforylering av tyrosin 15 (Bukrinsky og Adzhubei, 1999, Elder et al., 2002). Nylige studier har vist at Vpr-indusert G2-armering er dempet ved innføring av wee-1 siRNA eller deletjon av wee-1- genet (Yuan et al., 2004). Sammen med data på en dominant-negativ mutant av ATR og dets siRNA, ble ATR-Chk2-Wee-1 som en oppsummert signalvei postulert for å være ansvarlig for Vpr-indusert G2-arrestasjonen (Roshal et al., 2003; Yuan et al. . 2004, Zimmerman et al., 2004). Som en tidligere studie viste at ATM ikke var viktig for Vpr-indusert G2-arrestasjon (Bartz et al., 1996), har det ikke vært rapporter som beskriver aktiveringen av ATM under Vpr-uttrykk. For å undersøke VPR-induserte cellesyklusavvik, etablerte vi en MIT-23 cellelinje, hvor Vpr-ekspresjon er tett regulert av en tetracyklinpromotor (Shimura et al., 1999b). Vi fant at kontinuerlig ekspresjon av Vpr induserte dannelsen av TUNEL-positive mikronukleer og økte frekvensen av genamplifisering (Shimura et al., 1999a), hvilket innebærer at Vpr induserer DSB. Gjennom en analyse med en pulsfeltgelelektroforese på HIV-1-infiserte celler, oppdaget vi nylig et endret migrasjonsmønster av genomisk DNA med høy molekylvekt (Tachiwana et al., 2006), hvilket også innebærer at Vpr induserer DSB. Derfor er det nå viktig å avklare om en cellulær respons avhengig av ATM, en kinase aktivert selektivt av DSB (O'Connell et al., 2000; Khanna et al., 2001; Shiloh, 2001), er virkelig fremkalt av Vpr, og i så fall må vi avgjøre om Vpr er det store virusproteinet som er ansvarlig for ATM-aktivering.

DNA-skade er indusert av reaktive oksygenarter, ioniserende stråling og kjemikalier (Abraham, 2001), og repareres ved homolog rekombinasjon (HR) eller nonhomologous DNA end-joining (NHEJ) veier (Khanna og Jackson, 2001; van Gent et al ., 2001). Når en DSB er generert, behandles en 3 'enkeltstrenget DNA-hale, hvor replikasjonsprotein A (RPA) og Rad51, en eukaryotisk homolog av det bakterielle DNA-strengbytterprotein RecA (Cromie et al., 2001; West, 2003), akkumulere. Det ble vist at p53 og BRCA2 fosforylert ved serin 3291 binder Rad51 og undertrykker sin HR-aktivitet (Dong et al., 2003; Linke et al., 2003; Yoon et al., 2004). Funksjonell BRCA1 og 2 kreves når DSBs forekommer; ellers blir genomisk ustabilitet indusert, som observert hos kreftbenyttede individer med mutasjoner av disse genene (van Gent et al., 2001; Dong et al., 2003).

I denne rapporten viser vi først at Vpr induserte et ATM-avhengig cellesignal. Den cellulære responsen under Vpr-ekspresjon var lik den som forårsaket av røntgenbestråling som involverer BRCA1, RPA og Rad51. Vi demonstrerer nå at Vpr økte frekvensen av HR på en minibankavhengig måte. Data støtter ideen om at Vpr induserer DSB. Den mulige rollen som Vpr i viral infeksjon og i HIV-1-assosiert malign tumorutvikling er diskutert.

resultater

DSB-induserte cellesignaler av Vpr

I utgangspunktet undersøkte vi om DSB-avhengige cellulære signaler ble indusert av HIV-1-infeksjon. HT1080-celler ble infisert med virus uten (R-) eller med vildtype (R + ) av vildtype, og en immunhistokjemisk analyse ble utført. Som vist i figur la, akkumuleres y- H2AX etter infeksjon med R + viruset (høyre panel), men ikke med R - viruset (Figur 1a, midtpaneler). Western blot-analyse viste et høyt uttrykk av y- H2AX med fosforyleringen av p53 i celler infisert med R + -viruset (Figur 1b, felt 4 og 5). Viralkonsentrasjoner på 50 og 100 ng / ml p24 var tilstrekkelige for induksjon av y- H2AX. I motsetning til dette induserte ikke R - virus p53-fosforylering, selv om det økte litt p53-ekspresjon (Figur 1b, baner 2 og 3).

Aktivering av DSB-indusert signalering. ( a ) Fokusdannelse av y- H2AX i celler infisert med R- eller R + -virus. HT1080-celler ble infisert med R- eller R + -virus ved konsentrasjonen av 100 ng / ml p24 gag-protein. Etter 48 timer med infeksjon ble cellene farget med spesifikt antistoff mot y- H2AX. Signalene for y- H2AX er vist som røde flekker i kjernen (blå). ( b ) Western blot analyse av proteiner involvert i DSB-indusert signalvei. Celllysater av virusinfiserte og kontrollceller etter 48 timer ble underkastet analyse. Kontrollceller (bane 1), celler infisert med R - virus (bane 2 og 3), og celler infisert med R + virus (bane 4 og 5) er vist. To doser virus ved konsentrasjonen på 50 (spor 2 og 4) og 100 ng / ml p24 gag-protein (banene 3 og 5) ble anvendt. α -Tubulin indikerer at mengdene av ladede proteiner ikke er signifikant forskjellige.

Full størrelse bilde

For å karakterisere de intracellulære signalene spesifikt indusert av Vpr, brukte vi MIT-23-celler, hvor vpr mRNA-ekspresjon var tett regulert av tetracyklinpromotoren (Shimura et al., 1999b). I MIT-23-celler ble Vpr-ekspresjon observert i 48 timer etter behandling av 3 μg / ml doxycyklin (DOX) (figur 2a). Under slike forhold observerte vi fokusdannelse av ATM fosforylert ved serin 1981 (ATM-p) (figur 2b, øvre paneler) og y- H2AX (nedre paneler). I kontrast ble det ikke observert fokusdannelse av disse molekylene i MIT-23-celler uten DOX-behandling (venstre panel). I tillegg oppdaget vi ikke fokusdannelse av ATM-p eller y- H2AX i DOX-behandlede AVV-celler, hvor bare vpr- genet ble eliminert fra vektorer som ble benyttet for etablering av MIT-23-celler (data ikke vist). Western blot-analyse oppdaget også at DNA-skade-sensing-signaler ble indusert av Vpr-ekspresjon (figur 2c). Interessant nok var Chk2, et substrat av ATM, svært fosforylert ved treonin 68 ved Vpr-ekspresjon (figur 2c, felt 2). I tillegg økte p53-ekspresjonen så vel som dets fosforylering også som en nedstrøms respons av disse molekylene. I samsvar med den forrige rapporten som viser at Chk1, et substrat av ATR, aktiveres av Vpr (Roshal et al., 2003), observerte vi nærværet av det langsomt migrerende bandet av Chk1 som dets fosforylerte form under Vpr-uttrykk (data ikke vist) .

Aktivering av DSB-indusert cellesignalering. ( a ) Ekspresjonsprofiler av Vpr i MIT-23-celler. Vpr-ekspresjon ble indusert i 48 timer med 3 μg / ml DOX i MIT-23-celler. Vpr-ekspressionsnivået i MIT-23-celler ble analysert ved Western blotting med det Vpr-spesifikke antistoff 8D1. ( b ) Fokusdannelse av fosforylering av ATM (ATM-p) og y- H2AX etter Vpr-ekspresjon. Cellene ble farget med spesifikke antistoffer mot ATM-p og y- H2AX. Signalene for ATM-p og y- H2AX er avbildet som røde flekker i kjernen (blå). ( c ) Western blot-analyse av proteiner involvert i den DSB-induserte signalveien. Cellelysater av MIT-23-celler (banene 1 og 2) ble underkastet analyse. Som en positiv kontroll ble HT1080-celler bestrålt ved 7, 5 Gy, samlet etter 30 minutter og underkastet analyse.

Full størrelse bilde

For å sammenligne Vpr-induserte DSB-avhengige signaler med de ved røntgenbestråling, ble HT1080-celler bestrålt med 7, 5 Gy røntgenstråler, og de fremkalte signaler ble analysert. Som vist i figur 2b (høyre paneler) genererte røntgeninducerte DSBer fokusdannelse av ATM-p (figur 2b, øvre panel) og y- H2AX (nedre panel). I tillegg demonstrerte Western blot-analyse tydelig fosforyleringen av både Chk2 og p53 (felt 3 og 4). Data antyder at Vpr-induserte DNA-skadesignaler er ganske lik de som utløses av en velkarakterisert DSB-induktor.

Mobilisering av cellefaktorer som er involvert i reparasjon av DSB

For å ytterligere karakterisere molekylene aktivert som en cellulær respons på Vpr-induserte DSB, undersøkte vi BRCA1, RPA og Rad51 mobilisert for reparasjon av DSB (West, 2003). Som vist i figur 3 detekterte immunhistokjemisk analyse utført under Vpr-ekspresjon klart fokusdannelse av disse molekylene (figur 3). Kontrastceller viste derimot ikke bemerkelsesverdig modifikasjon av disse molekylene. Igjen induserte røntgenbestråling også samme modifikasjon av molekylene (figur 3, høyre paneler).

Engasjement av BRCA1, RPA og Rad51 i Vpr-indusert signalering. MIT-23-celler ble dyrket i nærvær eller fravær av 3 μg / ml DOX i 48 timer. Fokusformasjoner av BRCA1, RPA og Rad51 under Vpr-uttrykk vises. Disse signalene visualiseres som røde flekker i kjernen (blå).

Full størrelse bilde

Det har blitt foreslått at i løpet av DSB-reparasjonsprosessen frigis Rad51 fra et kompleks av p53 og blir kompetent for HR (Linke et al., 2003; Bertrand et al., 2004). For å løse denne muligheten, sammenlignet vi den fysiske sammensetningen av Rad51 og p53 i den uoppløselige kromatinfraksjon før og etter induksjonen av Vpr-ekspresjon. Samspillet mellom disse molekylene ble eliminert etter Vpr-ekspresjon (Figur 4a, bane 3 og 4, pil). Nivået på kompleksdannelsen av p53 og Rad51 redusert med 35% sammenlignet med kontrollen. Dette funnet er reproduserbart observert, hvilket innebærer muligheten for at Vpr binder enten Rad51 eller p53 og opphører deres interaksjon. Vi undersøkte direkte samspillet mellom Vpr og Rad51 ved å bruke rekombinante proteiner, men oppnådde ikke positive resultater (data ikke vist). Som det har blitt vist at Vpr ikke interagerer med p53 (Sawaya et al., 1998), forblir mekanismen for dissosiasjon av p53 og Rad51 i Vpr-uttrykkende celler klarert.

Dissociated interaksjon av p53 og Rad51 i en kromatinfraksjon under Vpr-ekspresjon. Lysatene av det oppløselige (spor 1 og 2) og uoppløselige kromatinfraksjoner (spor 3 og 4) underkastet analyse. Proteiner som ble immunpresipitert (IP) med anti-p53-antistoffet ( a p53) ble analysert ved Western blot-analyse (WB) med henholdsvis α p53 og α Rad51-antistoffene. Inndata lysater ble også analysert av de samme antistoffene og a histon H3 (HH3). Cellelysatet med (spor 2 og 4) eller uten (spor 1 og 3) Vpr-ekspresjon er vist ( a ). Den samme analysen ble utført på røntgenbestrålede celler ( b ). Arrowheads indikerer Rad51 gjenvunnet av α p53 antistoff.

Full størrelse bilde

Vi sammenlignet også denne molekylære forandringen med det som indusert av røntgenbestråling. HT1080-celler ble bestrålt, og den påfølgende forandring av interaksjonen av Rad51 og p53 ble undersøkt. Som observert i figur 4a ble også samspillet mellom Rad51 og p53 i den uoppløselige kromatinfraksjonen avskaffet (figur 4b, sammenligne bane 3 og 4, pil). Data tyder på at Vpr modifiserer Rad51 på samme måte som røntgenbestråling.

Økt frekvens av HR ved Vpr

DSBer må være riktig reparert, eller integritet kan ikke opprettholdes (Vest, 2003). Som Vpr inducerer DSB og cellulære faktorer som Rad51 og BRAC1 mobiliseres under Vpr-uttrykk, antydet vi at frekvensen av HR økte i Vpr-uttrykkende celler. For å måle HR, brukte vi først et system oppfunnet av Slebos og Taylor (2001) som kunne overvåke ekstrakromosomal rekombinasjon i et plasmid DNA (pBHRF). pBHRF inneholder en trunkerte EBFP-kassett, som danner en funksjonell EGFP etter intramolekylær HR (Slebos og Taylor, 2001). Vi samtransfekterte HT1080 med pBHRF og et plasmid DNA som koder for Vpr og undersøkte virkningen av Vpr på HR. Etter 72 timers transfeksjon ble EGFP- og EBFP-positive celler telt ved hjelp av flytcytometri (figur 5a, henholdsvis regioner a og b). Deretter ble frekvensen av HR beregnet som et forhold på antall celler positive for EGFP og EBFP. Det økte omtrent 2, 5 ganger ved ko-transfeksjon av et plasmid som koder for Vpr. Vpr-indusert forbedring av HR ble observert reproducerbart ( P <0, 05), og de representative resultatene er vist i figur 5b.

Økt hastighet av ekstrakromosomal HR ved Vpr. ( a ) Et representativt resultat av tre uavhengige eksperimenter med pBHRF. HT1080-celler ble ko-transfektert med pBHRF og pcDNA3.1 / Vpr (se avsnittet Materialer og metoder). Cellene ble underkastet analyse ved hjelp av flytcytometri etter 72 timer. Regioner a og b ble tentativt bestemt i en kontrollprøve. Disse indikerer områdene hvor celler som er positive for EGFP (region a) eller EBFP (region b) ikke var tilstede i ubehandlede prøver. Etter behandling ble celle tall i disse områdene telt og sammenlignet. ( b ) Økning av GFP-positive celler med Vpr. Forholdet mellom GFP-positive celler og BFP-positive celler, som indikerer HR-frekvenser (Slebos og Taylor, 2001), ble talt. Hver prøve ble analysert to ganger i tre eksemplarer; barer ± sd

Full størrelse bilde

Selv om forsøkene med pBHRF sterkt foreslo at Vpr øker HR, har det vist seg at en ekstrakromosomal HR ikke korrelerer med intrachromosomal HR. Waldman og Liskay (1987) viste tydelig at hyppigheten av ekstrakromosomale og intrachromosomale rekombinasjonshastigheter differensielt påvirkes av nukleotidernes mismatch. For å måle frekvensen av intrachromosoml HR under Vpr-ekspresjon på riktig måte, forberedte vi stabile transfektanter avledet fra HT1080-celler som hadde blitt introdusert med pDR-GFP. pDR-GFP er en reporterkonstruksjon som vil generere et intakt EGFP-gen ved genkonvertering etter fordøyelse med et sjeldent skjæreenzym, I- Sce I (Pierce et al., 1999). Vi oppnådde to uavhengige transfeksanter, HT / DR-GFP-1 og -2, som hadde et integrert eksogent plasmid-DNA som er kompetent for en kort-tarmgenkonvertering (tilleggsinformasjon 1a) (Pierce et al., 1999). Da ble HT / DR-GFP-celler infisert med adenovirus av enten Adβgal eller Ad-SceI-NG og utsatt for analyse av GFP-positive celler etter 72 timer. Etter infeksjon med Ad-SceI-NG ga begge klonene økt antall GFP-positive celler (ca. 0, 5%) (tilleggsinformasjon 1b og c). I motsetning til dette, Adββ, kontroll-adenovirus, induserte svært få celler positive for GFP (<0, 1%) (tilleggsinformasjon 1b og c).

Vi undersøkte da Vprs innflytelse på HR-frekvensen. Først introduserte vi et plasmid-DNA som koder for Vpr eller dets kontrollplasmid-DNA, men det var ikke mulig å vurdere virkningen av Vpr riktig fordi transfeksjon av plasmid-DNA i seg selv påvirket HR-frekvensen (data ikke vist). Det har blitt godt rapportert at Vpr går inn i celler og uttrykker sin biologiske aktivitet når den tilsettes til cellekulturen (Jenkins et al., 1998; Henklein et al., 2000; Huang et al., 2000; Taguchi et al., 2004). Disse observasjonene oppfordret oss til å utføre forsøkene ved å legge Vpr til celler eksogent med etterfølgende måling av GFP-positive celler. Vi forberedte en rekombinant Vpr (rVpr) (Hoshino et al., Sendt), og vi kontrollerte først om eksogent tilsatt rVpr induserer DSB-utløst cellrespons. rVpr (50 ng / ml; 3, 7 nM) tilsatt til medium-induserte DSB-avhengige signaler (Figur 6a), mens glutation S transferase (GST), et irrelevant rekombinant protein som ble uttrykt i bakterier og renset, ). Interessant nok avskaffet tilsetningen av ATM-inhibitoren KU55937 rVpr-indusert fokusdannelse av ATM-p og y- H2AX (figur 6a).

Økt frekvens av intrachromosomal HR etter behandling med rVpr. ( a ) Fokusdannelse av y- H2AX i celler behandlet med eller uten rVpr. HT1080-celler ble inkubert i 48 timer i nærvær av 3, 7 nM av rVpr (se Materialer og metoder) og underkastet immunhistokemisk analyse av antistoffer mot ATM-p og y- H2AX. Effekter av KU55933 på rVpr-indusert fokusdannelse av disse molekylene er vist. Som kontroller er virkningen av den samme konsentrasjonen av GST, som et irrelevant bakterieavledet rekombinant protein, avbildet (høyre panel). Deres signaler vises som røde flekker i kjernen (blå). ( b ) Effekter av rVpr på HR. HT / DR-GFP-celler (klon-1) ble infisert med Ad p Gal eller Ad-SceI-NG med eller uten tillegg av 3, 7 nM av rVpr (midtpanel). Som en kontroll ble samme mengde GST tilsatt til kulturen (høyre panel). En region hvor ingen GFP-positive celler var tilstede i kontrollprøven ble først bestemt (øverste venstre panel). Deretter ble antall celler i de gatede områdene telt i prøvene etter virusinfeksjon med eller uten behandling av rekombinante proteiner. ( c ) Vpr-indusert økning av HR er avhengig av ATM. Data oppnådd i figur 6b ble oppsummert (venstre panel). Tilsetningen av rVpr økte reproducibelt antall GFP-positive celler ( P <0, 01). Effekter av ATM-inhibitoren (ATMi) ble analysert ved de samme prosedyrene som er vist i figur 6b (høyre panel). KU55933 (ATMi) ble tilsatt ved en konsentrasjon på 1 m M samtidig som rVpr ble tilsatt. Som en kontroll ble den tilsvarende mengden dimetylsulfoksyd (sluttkonsentrasjon: 0, 1 volum), som ble anvendt som løsningsmiddel for forbindelsen, inkludert. ATMi hemmet signifikant frekvensen av HR ( P <0, 01).

Full størrelse bilde

Når rVpr ble tilsatt til HT / DR-GFP-1 (klon-1), ble HR spesielt etter infeksjon med Ad-SceI-NG-infisert definitivt forbedret (ca. 1, 5%), mens det ikke var bemerkelsesverdig endret ved tilsetning av GST (Figur 6b og c, venstre panel). Forskjellen i GFP-positive tall etter behandling med rVpr og GST var statistisk signifikant ( P <0, 01). Som mer slående bevis forsinket tillegget av KU55933 signifikant det økte antallet GFP-positive celler forårsaket av rVpr (Figur 6c, høyre panel) ( P <0, 01). Data indikerer at ATM er et kritisk molekyl for Vpr-indusert forbedring av HR.

Diskusjon

Vpr induserer DSB og forbedrer HR

I denne studien viste vi at Vpr aktiverer den ATM-avhengige signalveien som involverer Chk2-fosforylering med fokusdannelse av Rad51, BRCA1 og y- H2AX. Vi rapporterte tidligere at Vpr øker frekvensen av genamplifisering (Shimura et al., 1999a), og en etterfølgende analyse ved fluorescens in situ- hybridisering av amplifisert DNA foreslo at en brobruddfusjonssyklus, muligens utløst av DSB (Ishizaka et al., 1995), var en relevant modus for Vpr-indusert genforsterkning. Data som er vist i denne studien, støtter vel vår forventning om at Vpr forsterker genforsterkning ved å forårsake DSB (Shimura et al., 1999a).

Vi observerte at hyppigheten av HR økte som svar på Vpr. Vi undersøkte frekvensen av HR ved to systemer som måler ekstrakromosomal rekombination (Slebos og Taylor, 2001) og intrachromosomal rekombination (Pierce et al., 1999). Begge systemene oppdager celler som er positive for GFP generert ved genkonvertering. Selv om det er hevdet at disse to modifikasjonsmodusene ikke alltid oppdager cellulære rekombinogene forhold, oppdaget våre nåværende data at begge systemene oppdaget effekten av Vpr på HR. Det er interessant å merke seg at det intrachromosomale rekombinationssystemet som brukes i den nåværende studien oppdager HR på det spesifikke stedet i genomet, hvor DSB er indusert ved å uttrykke I- Sce I, et sjeldent skjærende enzym (Anglana og Bacchetti, 1999). Vi brukte to cellelinjer, som begge inneholdt reporterkonstruksjoner som var kompetente for korttegmentkonvertering (Pierce et al., 1999; Supplementary Information 1), og vi oppdaget økt HR-forbedring etter behandling med Vpr. Data tyder på at Vpr har en indirekte effekt på HR, noe som indikerer at DBS på ett sted bidrar til transaktivering av HR på et annet sted.

Som respons på Vpr-induserte DSB, akkumulerte BRCA1 og RPA som foci (figur 2b), og foreningen av Rad51 og p53 i kromatinfraksjonen ble eliminert (figur 3a og b). Det har blitt rapportert at p53 assosierer med flere proteiner, inkludert BLM, BRCA1, BRCA2, Rad52 og RPA (Yamaguchi-Iwai et al., 1998; Marmorstein et al., 1998; Zhang et al., 1998; Linke et al., 2003; Sengupta et al., 2003) og hemmer den Rad51-avhengige HR (Cromie et al., 2001; Linke et al., 2003). Når DSB ble indusert, ble forbindelsen av p53 og Rad51 forhindret ved en ukjent mekanisme. Da reduksjonen av Rad51 og p53-interaksjonen også ble observert etter bestråling (Figur 3c), er det sannsynlig at den Vpr-aktiverte DNA-skade-signaleringen overlapper cellesignalene fremkalt ved bestråling.

Biologisk relevans av Vpr-induserte DSB og HR for HIV-1 infeksjon

Vpr-uttrykk forbedrer HR-hastigheten, men flere rapporter tyder på at NHEJ i stedet for HR bidrar til virusinfeksjon (Daniel et al., 1999; Li et al., 2001; Jeanson et al., 2002; Lau et al., 2005) . I tillegg ble Rad52, en cellulær komponent av HR, vist å virke som en undertrykkende faktor for HIV-1-transduksjon (Lau et al., 2004). Sammen med data som sletting av gener involvert i HR, som XRCC2 eller XRCC3, ikke endret graden av viral integrasjon (Chan et al., 2004), virker det som at oppregulering av HR av Vpr ikke i seg selv bidrar til viral transduksjon.

I motsetning til dette øker kjemiske forbindelser som genererer DSBer graden av integrasjon av viralt DNA inn i vertsgenomet (Groschel og Bushman, 2005). Dette fenomenet har blitt forklart av forsinket progresjon i G2 / M-fasen på grunn av DSB. Videre er koffein- og koffeinrelaterte metylxantiner kjent for å forringe HIV-1-infeksjon (Nunnari et al., 2005), og en ATM-inhibitor, KU55933, er kjent for å redusere integrasjonen av virus-DNA i vertsgenomet (Lau et al., 2005). Disse observasjonene antyder at et DSB-indusert cellulært signal, ikke HR, er viktig for viral integrasjon, og at Vpr-indusert DSB bidrar til effektiv viralintegrasjon på en ATM-avhengig måte. Et viktig tema for å avklare er hvordan cellesignaler aktivert av ATM bidrar til økt viralintegrasjon.

Mulig mekanisme for Vpr-indusert DSB og celle syklus abnormitet

Mekanismen for Vpr-induserte DSB er for tiden uklar. I det foregående arbeidet viste vi at DSB er indusert ved inkubering av isolerte kjerner med renset rekombinant Vpr-protein (Tachiwana et al., 2006). Et renset Vpr hadde DNA-bindingsaktivitet, men det viste ikke noen nukleaseaktivitet eller aktivitet av nicking-DNA. I tillegg er Vpr til stede i kromatinfraksjonen (Ishizaka, upubliserte resultater, Lai et al., 2005), hvilket indikerer muligheten for at Vpr inducerer DSBer ved å modifisere en kromatinstruktur for å tillate nukleaser lett tilgang. En annen mulighet er at Vpr forbinder med ukarakterisert nuklease og rekrutterer sin aktivitet i nærheten av kromosomer. Studier pågår for å identifisere mobilfaktor (er) som letter rekruttering av Vpr til kromatin og induksjon av DSB.

Det er allment akseptert at Vpr-indusert cellecyklusabnormitet observeres ved G2 / M-fasen, men ikke i G1 / S-fasen (Mahalingam et al., 1998). Faktisk observert vi cellular akkumulering ved G2 / M-fasen i MIT-23-celler når Vpr-uttrykk ble initiert (Shimura et al., 1999b). Vår nåværende observasjon av aktiveringen av ATM-avhengig signalvei av Vpr antyder at Vpr-indusert celle syklus abnormitet er avhengig av ATM aktivering. En nylig studie har imidlertid vist at ATR-Chk1-banen, men ikke ATM-Chk2, er nødvendig for Vpr-indusert G2-arrestasjon (Roshal et al., 2003; Zimmerman et al., 2004). En mulig forklaring er at DSB-indusert G2-arrestere, for eksempel ved røntgenbestråling, avhenger i stor grad av ATR-avhengig signaling (Brown og Baltimore, 2003). Den molekylære koblingen mellom ATM-aktivering ved Vpr og Vpr-indusert cellecyklusabnormitet må imidlertid undersøkes nøye.

Virkning av Vpr-induserte DSB på mekanismen for tumorutvikling hos HIV-1-positive pasienter

Vi viste at DSB og en økt HR-hastighet ble indusert når rVpr ble tilsatt til dyrkningsmediet eksogent (Figur 6). Nylig fant vi også at Vpr er tilstede i serum hos HIV-1-positive pasienter (Levy et al., 1994) ved konsentrasjonen på ca. 0, 7 nM (Hoshino et al., Innleveret). I den nåværende studien brukte vi 3, 7 nM av rVpr for å oppnå den definitive aktiviteten som induserer DSB, men det ville være mulig at den høye konsentrasjonen av Vpr er tilstede i fokus på HIV-1-infeksjon, noe som tyder på at DSB kan genereres i celler innen HIV-1-positive pasienter. Funnet om at Vpr er tilstede i serum påvirker forståelsen av mekanismen for tumorutvikling hos HIV-1-positive pasienter. Som rapportert av Biggar et al., ble den relative risikoen for malignitet hos AIDS-pasienter anslått å være 60 til 1000 ganger høyere enn friske kontroller (Mayer et al., 1995; Biggar et al., 1996; Straus, 2001). Selv om det har blitt antatt at en nedsatt cellulær immunitet under AIDS-forhold tillater utvikling av tumorigenese (Knowles, 2003), viser nylige observasjoner at ikke-AIDS-definerende maligniteter, tumorer som finnes hos HIV-1-positive pasienter som ikke har forringet cellulær immunitet, blir ofte observert hos HIV-1-positive pasienter (Herida et al., 2003; Burgi et al., 2005; Lim og Levine, 2005). Siden antiretroviral terapi effektivt kan beskytte pasienter mot alvorlige smittsomme sykdommer (Chadburn og Cesarman, 1997, Elenitoba-Johnson og Jaffe, 1997), vil utviklingen av ondartede svulster i fremtiden være en kritisk prognostisk faktor for HIV-1-positive pasienter. Mer presis studie er nødvendig for å klargjøre molekylær binding av Vpr og ondartet transformasjon.

Materialer og metoder

Cellkultur og etablering av HT / DR-GFP

HT1080, en human fibrosarkomcellelinje (JCRB9113, Healthy Science Research Resources Bank) og dens underlinjer ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (D-MEM) som ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). MIT-23-cellelinjen ble avledet fra HT1080-celler, hvor Vpr-ekspresjon styres av en tetracyklinpromotor, som beskrevet av Shimura et al. (1999b). For Vpr induksjon ble 3 μg / ml DOX (Sigma, St Louis, MO, USA) brukt. For å oppnå HT / DR-GFP ble HT1080-celler transfektert med et inaktivt GFP-ekspresjonskassettplasmid (pDR-GFP) og valgt med puromycin (1 μg / ml) og klonale cellelinjer ble etablert.

HIV-infeksjon

Vi brukte pseudotypede virus som var defekte for et konvoluttprotein med vpr (R + ) eller uten vpr (R - ). HIV-vektorer ble produsert ved forbigående transfeksjon av 293T-celler (Tokunaga et al., 2001; Shimura et al., 2005). PNL-Luc-E - R + eller pNL-Luc-E - R - plasmidet ble samtransfektert med pHIT / G ved hjelp av transfeksjonsreagenset Fugene-6 (Roche, Tokyo, Japan). Virussupernatanter ble samlet inn ved 48 timer etter transfeksjon. De høstede supernatanter ble sentrifugert ved 120 g i 5 minutter og lagret ved -80 ° C. Viral titere ble målt ved p24 ELISA (ZeptoMetrix). Viruset ble fortynnet i D-MEM supplert med 10% FBS og pleide å infisere HT1080-celler ved en infeksjonsmengde (MOI) på 0, 8, noe som ga ca. 80% av celler som var positive for luciferaseuttrykk (data ikke vist).

Proteinanalyser

Cellene ble vasket med fosfatbuffert saltvann (PBS) og resuspendert i radioimmunpresipitasjonsanalysebuffer bestående av 50mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0, 25%. natriumdeoksykolat, 150 m M NaCl, 1 m M EGTA, 1 m M fenylmetylsulfonylfluorid, 1 μg / ml proteaseinhibitorblanding, 1 m M Na 2 VO 3 og 1 m M NaF. Cellesuspensjonen ble sonikert. For fraksjonering av kromatinfraksjoner ble celler suspendert i buffer N (15mM Tris-HCl (pH 7, 5), 60mM KCl, 15mM NaCl, 5mM MgCl2, 1m M CaCl2, 1m M DTT, 2 m M Na 2 VO 3, 250 m M sukrose, proteaseinhibitorer) med 0, 6% NP-40. Celler ble inkubert på is i 5 minutter etterfulgt av sentrifugering (2000 g ) for å separere cytoplasmatiske proteiner fra kjerner. Isolerte kjerner ble deretter vasket to ganger med Buffer N etterfulgt av resuspendering i Lysis-buffer (10mM PIPES (pH 6, 5), 10mM EDTA, proteaseinhibitorer) og sentrifugering (6000 g ) for å ekstrahere oppløselige nukleære proteiner. Til slutt ble kromatin resuspendert i Lysis-buffer og delt ved sonikering på is for å ekstrahere kromatinbundne proteiner. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt under anvendelse av BCA-proteinanalysereagensettet (Pierce). En 100 μg alikvot av protein fra hvert celleekstrakt ble separert på 10% SDS-PAGE. Spesifikke primære antistoffer av p53 (Calbiochem), Chk2, ATM-S1981 (ATM-p), H2AX-S139 ( y- H2AX) og histon H3 (Upstate), Chk2-T68 (Chk2-p) og p53-S15 (p53- p) (Cell Signaling) ble brukt til analyse. Et monoklonalt antistoff mot Vpr, 8D1 (IgG2a) ble økt ved immunisering av et fullverdig Vpr-peptid (Peptide Institute).

Immunutfelling ble utført ved anvendelse av 500 μg protein blandet med 2 μg anti-p53 protein-spesifikke IgG-perler. Ternære komplekser av protein A-antistoff-antigen ble samlet ved sentrifugering og vasket tre ganger. Immunprecipitatene ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av Western blot-analyse. For å oppnå et kaninantistoff mot RAD51 ble det humane Rad51-protein uttrykt som et rekombinant protein i Escherichia coli- stammen JM109 (DE3) (Kagawa et al., 2001) og ble renset som tidligere beskrevet (Kurumizaka et al., 1999) . Deteksjon av målproteiner var med et forbedret kjemiluminescensdeteksjonssystem (Amersham Biosciences).

farging

Cellene ble vasket med PBS og fiksert med 2% paraformaldehyd i PBS og iskald metanol. De faste celler ble permeabilisert med 0, 2% Triton X-100 i PBS i 5 minutter. Etter behandling med PBS inneholdende 10% geitserum i 30 minutter ble cellene inkubert med primære antistoffer som inkluderte kaninpolyklonale antistoffer mot Rad51 (1: 400), musmonoklonale antistoffer mot ATM-p (1: 100) og y- H2AX ( 1: 100) (Upstate) og musmonoklonale antistoffer mot BRCA1 (1: 300) og RPA (1: 1000) (Lab Vision). Etter 1 time inkubering ved 37 ° C ble sekundære antistoffer konjugert med Alexa 546 (1: 1000; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) tilsatt i 1 time ved 37 ° C. Lysbildene ble montert i en anti-fade løsning (KPL) og analysert ved fluorescensmikroskopi.

Homolog rekombinationsassay

Graden av ekstrakromosomal HR ble vurdert som tidligere beskrevet (Slebos og Taylor, 2001). HT1080-celler ble ko-transfektert med pBHRF og pcDNA3.1 / Vpr eller pcDNA3.1 (Invitrogen). pBHRF koder for både en avkortet GFP og full lengde BFP. I fravær av HR er bare BFP uttrykt. Men HR mellom BFP og avkortet GFP resulterer i opprettelsen av en funksjonell GFP. De grønne og blå fluorescensnivåene ble undersøkt samtidig ved bruk av et Vantage-flowcytometer (Becton-Dickinson) utstyrt med en 488-argon laser (GFP) og en UV (350-360 nm) laser (BFP). vpr ble avledet fra en NL4-3 klon (Adachi et al., 1986). Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og statistisk analyse ble utført av Studentens t- test.

Graden av intrachromosomal HR ble vurdert som rapportert i humane gliomceller (Pierce et al., 1999). Ved infeksjon med Ad-I-Sce-I, en god gave fra Dr. F Graham (McMaster University, Canada) eller Ad-Lac8 (en gave fra Dr I Saito, Tokyo University) som en kontroll, GFP-positive celler som et resultat av HR ble analysert. KU55933, en gave fra Dr M O'Connor (KuDOS Pharmaceuticals, England) ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO). GFP ble analysert med laserscanningcytometer (LSC; Olympus, Tokyo, Japan) (Huang et al., 2006). Celler dyrket i dekselet ble nedsenket i 0, 2% Triton X-100 i PBS i 10 minutter. Lysbildene ble deretter inkubert med anti-GFP antistoff (1: 100; Molecular Probes) før tilsetning av Alexa Fuor 488 konjugert sekundært antistoff (1: 400; Molecular Probes). Grønn fluorescensutslipp ble målt med LSC. Den integrerte fluorescensen ble målt i 10 000 celler for hver prøve. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger, og statistisk signifikans ble undersøkt.

Ekspresjon og rensing av rVpr

rVpr ble uttrykt i BL-21 codon plus (Stratagene) som et GST-fusjonsprotein og renset ved anvendelse av glutation-søylekromatografi, som beskrevet (Hoshino et al., sendt). Vpr eluert etter presisjonsbehandling ble påført på en affinitetskolonne koplet med et monoklonalt antistoff mot Vpr, 8D1. Etter vask ble Vpr eluert med 100 m M Hepes buffer (pH 2, 5) og umiddelbart nøytralisert med 1 M Hepes buffer (pH 8, 0). Konsentrasjonen av rVpr ble målt ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentanalyseversjon-1 ved bruk av to antistoffer mot Vpr, et monoklonalt antistoff (8D1) og et polyklonalt antistoff hevet mot et peptid av karboksy-terminalen til Vpr (IBL).

Tilleggsinformasjon

Bildefiler

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon-1

Tilleggsinformasjon følger med på papiret på Oncogene nettsiden (//www.nature.com/onc).

Anbefalt Redaksjonens