Anonim

Temaer

  • malaria

Abstrakt

En malaria-vaksine som forhindrer infeksjon, vil være et viktig nytt verktøy i fortsatt arbeid med malaria-eliminering, og slike vaksiner er under intens utvikling for den største malaria parasitten Plasmodium falciparum ( Pf ). Antistoffer fremkalt av vaksiner kan blokkere de første faser av parasittinfeksjon når sporozoitter legges inn i huden ved myggbit og deretter målrette leveren for videre utvikling. Imidlertid er det for øyeblikket ingen standardiserte in vivo prekliniske modeller som kan måle den hemmende aktiviteten av antistoff-spesifisitet mot Pf- sporozoittinfeksjon via myggbit. Her bruker vi humane leverkimære mus som en utfordringsmodell for å vurdere forebygging av naturlig Pf- sporozoittinfeksjon av antistoffer. Vi demonstrerer at disse musene konsekvent er infisert med Pf ved myggbit og at denne utfordringen kan kombineres med passiv overføring av enten monoklonale antistoffer eller polyklonalt humant IgG fra immunserum for å måle antistoff-mediert blokkering av parasittinfeksjon ved bruk av bioluminescerende bildebehandling. Denne metoden er nyttig for nedvalg av funksjonelle antistoffer og for å undersøke mekanismer eller immunforsvar for beskyttelse i kliniske studier, og derved informere rasjonell vaksineoptimalisering.

Introduksjon

Til tross for betydelig innsats og betydelige fremskritt i å redusere malariabyrden i mange land i løpet av de siste tiårene, led over 200 millioner mennesker fortsatt av denne parasittiske sykdommen i 2015, noe som resulterte i over 400.000 dødsfall som hovedsakelig skyldes infeksjon med Plasmodium falciparum ( Pf ) (WHO 2015). En vaksine som er i stand til å forhindre malariainfeksjon, ville forhindre sykdom, død og videre parasittoverføring og som sådan ville utgjøre et kritisk verktøy for sykdomsreduksjon samt parasittutryddelse. Imidlertid har alle lisensierte vaksiner til dags dato målrettet virus og bakterier, og selv om utviklingen av malarialvaccin har vist noen siste fremskritt, har en vaksine som er i stand til å levere høye holdbarhet fra Plasmodium parasitter, ennå ikke blitt utviklet.

Under deres komplekse livssyklus innen pattedyrsverten presenterer malariaparasitter flere mål for antistoff-mediert interferens med infeksjon, noe som gir en sterk begrunnelse for at antistoffbaserte vaksiner effektivt kan forstyrre parasitttransmisjonssyklusen og forhindre sykdom og død. Hele forsvunnet parasittvaksinekandidater og subunit-vaksine kandidater kan både fremkalle beskyttende antistoffrespons som er i stand til å nøytralisere eller ødelegge parasitten under infeksjon. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Forsvarte parasitter stimulerer et bredt antistoff og T-cellemidlet adaptivt immunrespons mot mange parasittantigener. Subunitsvacciner utgjør en smalere tilnærming hvor rekombinante eller vektoriserte parasittantigener (e) er formulert med en immunstimulerende adjuvans for å fremkalle en antigen-spesifikk respons.

Antistoffer kan blokkere Plasmodium parasittinfeksjon i huden umiddelbart etter overføring, som oppstår når en infisert Anopheles mygg injiserer tiere til noen få hundre sporozoite stadier under en bit. Sporozoitter er svært motile og krysser flere celletyper på jakt etter et blodår, noe som gir dem tilgang til blodsirkulasjonen. I gnagermodeller av malaria ble det vist at antistoffer rettet mot sporozoitt effektivt kan forhindre passage av sporozoitt i leveren ved å redusere antall sporozoitter som kastes ut fra myggproblemet og også immobilisere sporozoitt i dermis, og dermed hindre deres tilgang til sirkulasjon. 9, 10 Sporozoittmotilitet og celletravers er prosesser som krever unike utskillede og membranforankrede proteiner, som kan være målrettet med antistoffer for å forhindre tilgang til blodsirkulasjonen. 11, 12 En gang i omløpet transporteres sporozoitter raskt til leveren hvor de igjen krysser flere celletyper når de krysser leveren sinusformet barriere og smitter deretter en egnet hepatocytt. Å forlate sirkulasjonen for å komme inn i leverparenchymen gir også en mulighet for antistoff-mediert infeksjonsforebygging, da sporozoitter blir utsatt for sirkulerende antistoffer som kan målrette mot flere sporozoitproteiner involvert i celleovergang og invasjon, som potensielt forhindrer hepatocytinfeksjon og følgelig parasittreplikasjon i leveren. Dette forhindrer i sin tur frigjøring av exo-erytrocytiske merozoitter og etablering av en blodstadieinfeksjon og tilhørende dødelighet og morbiditet. 1. 3

Sporozoitt- og leverstadiene, som kollektivt kalles for-erytrocytiske (PE) stadier av parasitten, er asymptomatiske og er derfor attraktive vaksinmål. Forebygging av PE-stadier av infeksjon vil forhindre all sykdom og etablering av sirkulerende seksuelt stadium parasittpopulasjoner som er overførbare. Faktisk er det iverksatt tiltak for å identifisere nye antistoffmål for PE-stadier basert på omfattende sporozoitt overflateproteom og hemmelige data og en mer dybdegående molekylær forståelse av de biologiske prosessene av parasittcelletransversal og hepatocyt invasjon. 14, 15 Imidlertid er prekliniske laboratorieanalyser for å vurdere infeksjonsinhiberende antistoffer ekstremt begrenset. Tradisjonelt har gnavermalariamodeller blitt brukt til aktiv immunisering eller for passiv overføring av polyklonale eller monoklonale antistoffer etterfulgt av sporozoittutfordring. Imidlertid er det vesentlig evolusjonær avvik mellom malariaparasittarten som smitter gnagere og mennesker, og begrenser gnavermalariamodellene som prediktive prekliniske eksperimentelle systemer. Transgene malaria parasitter med individuelle Pf antigener av interesse er opprettet som broverktøy, men disse er begrenset i typen og antall antigener som kan vurderes. 16, 17, 18 Således kan prekliniske in vivo-modeller som direkte vurderer antistoffvirkning mot Pf- utfordring, være ekstremt nyttige for å informere hvilke antigenkandidater som skal avanseres til kliniske studier ved bruk av kontrollert humant malariainfeksjon (CHMI). 19 Uten robust preklinisk bevis for beskyttende effekt av subenhetsvaksinekandidater mot Pf- utfordring, har CHMI-studier resultert i mange feil i vaksykandidatene tidligere. 20, 21, 22, 23, 24, 25 Selv om in vitro-analyser for å evaluere antistoff-mediert beskyttelse mot Pf- sporozoittinfeksjon er blitt etablert ved bruk av monokulturer av hepatomceller eller primære humane hepatocytter 26 de ikke rekapitulerer sporozoitt infeksjonsruten fra huden til leveren og kan derfor ikke fange antistoffaktiviteter som blokkerer parasitten før hepatocytinfeksjon. 13, 27, 28

En bro mellom prekliniske in vitro-analyser og humane CHMI-forsøk kan bygges med lever-humaniserte mus, som fullt ut støtter Pf PE-infeksjon. 29, 30 Måling av parasittleverstadiet byrde kan da brukes til å vurdere passivt overført antistoff effekt. 6, 31, 32 Vi har tidligere vist at disse leverkimære humaniserte musene (referert til som FRG huHep-mus), når de utfordres med en luciferase-uttrykkende Pf- parasitt, kan brukes til å detektere antistoff-mediert reduksjon i leverinfeksjon ved bioluminescerende avbildning. 2, 29, 33, 34 Her bruker vi FRG huHep-mus for å utvikle en robust plattform for å evaluere beskyttelseseffekten av antistoffer mot naturlig Pf- infeksjon. Vi demonstrerer at denne modellen kan differensiere monoklonale antistoffer (mAbs) med varierende infeksjonsblokkerende aktivitet og måle infeksjonsblokkerende aktivitet av polyklonalt immun IgG fra humane frivillige immunisert med hele sporozoitter. Vi har også tilpasset denne modellen for å måle antistoff-mediert steril beskyttelse ved hjelp av en fysiologisk relevant utfordringsdose. Det var viktig at myggbitt utfordring av FRG huHep-mus diskriminert antistoffytelse som var overlegen mot in vitro-analyser, noe som indikerte betydningen av å bruke den naturlige Pf- parasittinfeksjonsruten ved vurdering av inngrep mot PE-infeksjon.

resultater

Pf leverinfeksjon etter myggbitt utfordring

For å bestemme antistoffinhiberende funksjon in vivo brukte vi den naturlige myggbitt-infeksjonsruten, i motsetning til intravenøs (iv) injeksjon av sporozoitter, som tidligere har vært brukt, men omgår hudfasen og er mindre følsom for antistoff-mediert inhibering. 33, 35 Myggbittinfeksjon er imidlertid utfordrende å standardisere, da det er vanskelig å kontrollere den nøyaktige sporozoittdosen. Dermed spurte vi først om FRG huHep musinfeksjon med Pf- parasitter 36 av myggbit bidrar til en levetid for parasittstadier av tilstrekkelig størrelse og konsistens. Vi utfordret dermed FRG huHep-mus med 25, 50, 75 eller 100 Pf GFP_luc-infiserte mygg hver i 10 minutter. Leverstadiebelastningen ble deretter kvantifisert via bioluminescens på dagene 4-6 etter infeksjon (figur 1a). Alle musene hadde påviselig leverinfeksjon på dag 4 som økte på dag 5 og 6 i samsvar med parasittleverstadiet vekst over tid (figur 1b). På dag 6 var alle infeksjoner statistisk like bortsett fra 25-bit-gruppen, som var signifikant lavere enn både 100 og 75 bitgrupper ( p = 0, 0021 og 0, 0427 ved henholdsvis toveisanalyse av varians (ANOVA) for hver dag, Figur 1b og tabell 1). Gitt at 50 smittede myggbitt resulterte i lignende leverstadiebelastning sammenlignet med 75 og 100 myggbitt (Tabell 1), valgte vi 50 biter som standarddose for alle videre eksperimenter. Denne dosen viste seg å være konsistent når det gjelder å oppnå en høy grad av leverstadieinfeksjon hos alle mus med en rimelig grad av variasjon som tillot oss å oppdage antistoffmedierte reduksjoner i parasittleverinfeksjon i etterfølgende eksperimenter (tilleggsbilde S1).

FRG huHep-mus er utsatt for P. falciparum- infeksjon av myggbit og parasittets leverstadiebelastning kan måles noninvasively ved bioluminescerende bildebehandling. en generell skjematisk overføring av passiv overføring og myggbitt-infeksjon av FRG huHep-mus. Mus administreres antistoff 16-24 timer før infeksjon med Pf GFP_luc-infiserte mygg etterfulgt av påfølgende vurdering av leverstadiebelastning ved bioluminescens ved 4-6 dager etter infeksjon. b Mus ble utsatt for biter på 25, 50, 75 eller 100 mygg og sporet for leverstadiebelastning fra dag 4-6. Individuelle mus er vist som datapunkter med gjennomsnittet for hver gruppe vist ved den fargelignende forbindelseslinjen

Full størrelse bilde

Full størrelse bord

Ikke-invasiv kvantifisering av Pf- parasittbelastning i leveren etter passiv antistoffoverføring

Bioluminescerende bildebehandling er en rask og ikke-invasiv metode for å vurdere parasittleverstadiet. Våre første forsøk med bruk av myggbittinfeksjon viste imidlertid variabilitet innen hvert eksperiment, noe som kunne utelukke vurdering av små endringer i parasittbelastning som de som forårsaket av moderat inhibering av infeksjon med antistoffer. Dermed sammenlignet vi bioluminescerende bildebehandling og kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR) ved bruk av parasittspesifikke prober for å detektere antistoff-mediert reduksjon av leverinfeksjon. Sistnevnte metode innebærer RNA-ekstraksjon fra infisert lever og deteksjon av parasitt-RNA ved hjelp av qRT-PCR. 6, 31 Vi sammenlignet disse to metodene ved å vurdere effekten av passiv overføring av 5, 50 og 150 μg av et anti-circumsporozoitt protein (CSP) mAb på leverenivåbelastning. Et skjematisk eksempel på prøvetaking av infiserte levere ved begge metoder er vist i figur 2a. Seks dager etter myggbittinfeksjon var leverstapelbyrden påviselig i alle mockbehandlede mus (mus som mottok en ekvivalent dose ikke-spesifikk IgG) ved både bioluminescerende bildebehandling og qRT-PCR (figur 2b) med betydelig variasjon i begge (koeffisient av varians av 296 og 56% for henholdsvis qRT-PCR og bioluminescens). Begge metodene oppdaget en signifikant reduksjon av leverstadiebelastningen etter passiv overføring av 150 ug anti-CSP mAb med 3/5 mus med detekterbar leverbyrde ved qRT-PCR og 5/5 ved bioluminescerende avbildning (figur 2b). Mens bioluminescerende bildebehandling kunne skille forskjeller i leverstadiet parasittbelastning i mus gitt 5 og 50 μg mAb, kunne ikke qRT-PCR skyldes den store variasjonen i signalet (figur 2b). Disse resultatene indikerer at både bioluminescerende bildebehandling og denne metoden for qRT-PCR oppdager forholdsvis store forskjeller i leverstadiet, men at den tidligere kan være mer nyttig ved diskriminering av moderate reduksjoner i leverstadiebelastningen.

Bioluminescerende bildebehandling er like nøyaktig som qRT-PCR for vurdering av leverstadiebelastning. en skjematisk representasjon av leverprøvetaking med qRT-PCR (øvre paneler) og bioluminescens (nedre paneler). Prøvetaking av lever med biopsipunch for qRT-PCR er indikert med 12 sirkler hvor grønne sirkler indikerer prøver hvor parasitt RNA vil bli detektert og rødt som ville være negativt hos mus med høy leverbelastning (venstre) og lav leverbarhet (til høyre) . I motsetning til dette er vurdering av leverbelastning ved bioluminescens vist i bunnpanelene og indikerer et representativt område av interesse som kan fange hele leveren. b FRG huHep-mus ble administrert angitte doser anti-CSP mAb 2A10 eller 150 μg ikke-spesifikt murint IgG (mock). Den følgende dagen ble musene infisert med 50 Pf GFP_luc myggbitt og vurdert for leverbyrde på dag 6 ved bioluminescerende avbildning. Umiddelbart etter avbildning ble musene avlivet og 12 prøver fra hver lever ble samlet og kombinert for RNA-isolasjon og kvantitasjon av leverbelastning med qRT-PCR. Leverbelastning ved både qRT-PCR (venstre y- aksen) og bioluminescens (høyre y- akser) vises med hvert datapunkt som representerer den gjennomsnittlige leverbelastningen fra de 12 leverdelene fra en mus for qRT-PCR og den totale fluxen for hver mus målt ved bioluminescens

Full størrelse bilde

FRG huHep musutfordring for å vurdere funksjonell aktivitet av mAbs

Vi testet deretter om FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen kunne brukes til å måle forskjeller i forebygging av leverinfeksjon med forskjellige mAbs som målretter mot det samme sporozoitt antigenet. Til dette formål overførte vi passivt tre forskjellige mAbs av musestart som gjenkjenner NANP-repeteringsområdet av Pf CSP ved 150 μg / mus: mAb klon 2A10 (murin isotype IgG2b), mAb1 (murin isotype IgG1) og mAb2 (murin isotype IgG1) . mAb 2A10 reduserte leverinfeksjon til 51% mockbehandlede mus, mens mAb1 og mAb2 reduserte leverinfeksjonen signifikant til henholdsvis 10 og 31% mockbehandlede mus (figur 3). For å avgjøre om isotypen av mAb påvirket antistofffunksjonen, testet vi også varianter av mAb1 og mAb2 med isotyper som er kjent for å bedre formidle Fc-avhengige funksjoner. 37 Både mAb1-IgG3 og mAb2-IgG2a utførte tilsvarende på deres IgG1-isotype-kolleger, hvilket indikerte at antistoffisotype ikke var en faktor for in vivo-ytelse i disse forsøkene (figur 3). Resultatene med disse mAbs var konsistente mellom replikateksperimenter (indikerte med forskjellige farger i figur 3) til tross for forskjeller i leverstadiebelastning av mockgrupper (tilleggsbilde S1). Det er viktig at hierarkiet i infeksjonshemmende aktivitet av hvert mAb, hvor mAb1> mAb2> mAb 2A10, ikke ble observert ved in vitro inhibering av sporozoitt-traversal og invasion (ISTI) -analyse hvor alle mAbs utførte tilsvarende (tilleggsbilde S2). Dette indikerer at vurderingen av antistofffunksjonen in vitro kanskje ikke fullt ut avslører den inhibitoriske aktiviteten på sprozoitt infeksjon observert in vivo.

Monoklonal Abs av flere Fc-isotyper og arter kan vurderes i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen. FRG huHep-mus mottok 150 μg / mus av ikke-spesifikt IgG, mAb 2A10 eller to nye anti-CSP mAb før myggbittinfeksjon og måling av leverstrinnsbyrde. Arter og isotype er angitt for hvert mAb (f.eks. MIgG1 for "murin IgG1" og "hu" for humant). Data ble samlet inn over fire uavhengige eksperimenter med 1-3 eksperimenter / mAb og 4-5 mus / gruppe / eksperiment. Hvert datapunkt representerer en mus og mus innenfor samme eksperiment er merket i samme farge. Barer angir gjennomsnittlig ± SEM med tall over hver linje som angir gjennomsnittet% av mock for den gruppen. Stjerner indikerer statistisk signifikans i enveis ANOVA som sammenligner med mock-injiserte mus i de samme uavhengige eksperimenter. Individuelle sammenligninger mellom mAb av samme spesifisitet men forskjellige Fc-isotyper / arter er indikert med linjer. ** er 0, 01> p > 0, 001, **** er p <0, 0001

Full størrelse bilde

For å øke bruken av FRG huHep utfordringsmodellen, vurderte vi om mAbs av human opprinnelse også kan testes (dvs. avledet fra B-celler fra vaksinerte frivillige). mAbs med humane Fc-regioner opprettet en art mismatch mellom antistoff Fc-regionen og murine Fc-reseptoren, og dette kunne redusere bidraget av Fc-avhengige effektorfunksjoner og uklar beskyttelsesstatus. 38 Vi observerte imidlertid at passiv overføring av en versjon av mAb1 inneholdende en human IgG3 (huIgG3) Fc-region ga tilsvarende resultater sammenlignet med dets murine motstykker (figur 3). Samlet sett indikerer disse dataene at FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen diskriminerer forskjellige mAb-blokkeringsaktiviteter og muliggjør funksjonell vurdering av mAbs av forskjellige Fc-isotyper av både murin og human opprinnelse.

Inhiberende aktivitet av polyklonalt IgG fra hele sporozoitt-immuniserte frivillige

Vi vurderte deretter den hemmende aktiviteten til humane polyklonale antistoffer samlet etter immunisering av frivillige med levende demperte Pf- sporozoitter.

Immun serum eller plasma fra malaria vaksineforsøk er ofte begrenset, og i tidligere studier ved bruk av passiv overføring av huIgG, ble dosen av IgG diktert ved hjelp av prøvetilgjengelighet. 2, 34 For først å karakterisere rekkevidden av huIgG-hemmende aktivitet i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen, ble polyklonalt huIgG samlet fra prøver samlet fra hele sporozoittimmuniserte frivillige 2, 34 overført passivt ved 0, 5, 2, 4, 8 og 16 mg / mus. Vi oppdaget signifikante reduksjoner i parasittleverstadiebelastningen sammenlignet med mus som mottok ekvivalente doser preimmun huIgG ved doser så lave som 4 mg / mus (figur 4a). Serumnivåene av huIgG hos mus som mottok disse hemme-dosene ved utfordringstidspunktet var i gjennomsnitt 1, 5, 4, 5 og 8, 3 mg / ml for henholdsvis doser på henholdsvis 4, 8 og 16 mg / mus (figur 4b). Sammen viser disse dataene at en rekke huIgG-konsentrasjoner kan brukes til å bestemme antistofffunksjonalitet i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen, og at en dose på 16 mg / mus nøyaktig kan rekapitulere konsentrasjonen av huIgG observert i humant serum. 39

Humant polyklonalt IgG kan brukes over et bredt doseringsområde i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen. FRG huHep-mus ( n = 4-5 / gruppe) mottok indikerte doser av sammensatt preimmun eller immun polyklonalt IgG ved angitte doser. en parasitt leverstadiebelastning ble målt på dag 6 etter 50 myggbittutfordring og leverstadiebelastningen av hver mus som mottok huIgG fra immuniserte frivillige (Immune) ble normalisert til gjennomsnittet av dose-matchet huIgG fra de preimmuniserte frivillige (Pre -immun). Middel ± SEM er tegnet med sammenligninger mellom pre-immune og immune leverstadiebelastninger utført ved Mann-Whitney U- test. Stjerner indikerer en signifikant forskjell mellom midler der * er p <0, 05 og ** er p <0, 01. b Mus ble blødt umiddelbart før utfordring og serum ble samlet for måling av sirkulerende huIgG ved ELISA. Konsentrasjon er avbildet på y- aksen med gjennomsnittlig ± SEM plottet for hver gruppe. Inkludert er grupper av mus som mottok et murint anti-CSP mAb eller PBS (negative kontroller, henholdsvis n = 2 og 6)

Full størrelse bilde

Vi brukte neste gang huIgG isolert fra frivillige immunisert med hele sporozoitter og senere utfordret av CHMI. Det første settet av huIgG ble avledet fra frivillige immunisert med fire doser 2, 7 x 10 5 renset, kryopreserverte bestrålede sporozoitter (PfSPZ). 2 CHMI 6 måneder etter endelig immunisering demonstrerte beskyttelse hos 6/11 frivillige. 2 Vi oppnådde tilstrekkelig prøve for å overføre 8 mg huIgG / FRG huHep-mus ( n = 3-10 mus / frivillig) tatt på tidspunktet for CHMI fra fem beskyttede og fire ikke-beskyttede frivillige. Kontroll FRG huHep-mus fikk 8 mg / mus av sammensatt preimmune huIgG fra alle ni frivillige og alle mus ble utfordret av 50 Pf GFP_luc-infiserte myggbitt. Sammenlignet med mus som mottar sammenbundet preimmune huIgG, reduserte immunhoIgG fra 4/5 beskyttede frivillige signifikant parasittleverinfeksjon mens immunhoIgG fra bare 1/4 ikke-beskyttede frivillige viste signifikant reduksjon av leverinfeksjon (figur 5a). Når de grupperte sammen, opplevde mus som mottok immun huIgG fra beskyttede frivillige, signifikant redusert leverskade for parasitt (38% av immunforsvaret) sammenlignet med mus som mottok huIgG fra ikke-beskyttede frivillige, som bare hadde en ikke-signifikant (66, 6% immun) reduksjon i leverstadiebelastning (figur 5b). Imidlertid var denne sammenhengen ikke tydelig på individuel frivillig basis, da den gjennomsnittlige parasittleverbyrden hos mus som mottok huIgG fra en enkelt frivillig (dvs. 1 middel / frivillig) ikke var statistisk lavere for individer i den beskyttede gruppen i forhold til de ikke- beskyttet gruppe til tross for lavere numerisk verdi (figur 5c). Dermed var antistoffinhiberende funksjon in vivo ikke et klart sammenheng med beskyttelse for frivillige i denne studien. Uansett er det ikke observert de observerte trendene i forskjellene mellom beskyttet versus ikke-beskyttet huIgG ved hjelp av en in vitro-ISTI-analyse hvor IgG fra 3/3 ikke-beskyttede frivillige testet signifikant hemmet sporozoitt invasjon, mens IgG fra bare 3/5 beskyttede frivillige viste signifikant hemming av invasjon (tilleggsbilde S3A, B). Sammenligning av in vitro inhibering av enten celletransversal eller invasjon av FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsdata ga også ingen korrelasjon mellom de to analysene som antyder en fundamental forskjell mellom sporozoittinfeksjon i in vitro-analysen og in vivo-analysen (Supplemental Fig. S3C ) . Til slutt inneholdt in vivo-data et replikat med en delmengde av immun huIgG for å vurdere reproduksjonsevnen. Vi fant resultater for å være konsistente mellom eksperimenter ved hjelp av forskjellige grupper av Pf GFP_luc-infiserte infiserte mygg (tilleggsbilde S4).

FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen kan skille funksjonell fra ikke-funksjonelle antistoffer fra humane frivillige. FRG huHep-mus ble administrert 8 mg / mus av IgG fra frivillige 6 måneder etter immunisering med fire doser på 2, 7 x 10 5 bestrålede sporozoitter (PfSPZ) og umiddelbart før utfordring av smittsom myggbit. Mus ble deretter smittet av bit av 50 Pf GFP_luc-infiserte mygg og leverstadiebelastning vurdert på dag 6 etter infeksjon. Data som vises er en kombinasjon av to uavhengige eksperimenter som angitt i figur S4 og uttrykt som en prosent av før-immun-parasittens leverbyrde (% av preimmun). En leverstadiebelastning av mus ( n = 3-10 / frivillig) som mottok postimmunisering IgG ble normalisert til mus som mottok poolet preimmun IgG ( n = 13). Datapunkter vises med stenger som gjennomsnittlig ± SEM for hver frivillig gruppert etter beskyttelsesstatus. Stjerner indikerer signifikante forskjeller fra preimmungruppen, målt ved enveis ANOVA med Kruskal-Wallis post-test. b Dataene er innrettet slik at hver mus er plottet som et enkelt datapunkt og gruppert i henhold til deres behandling, preimmun huIgG, immun huIgG fra en CHMI-beskyttet frivillig eller immun-huIgG fra en ikke-beskyttet CHMI-frivillig. Over hver gruppe er den gjennomsnittlige% av preimmune samt stjerner som indikerer en signifikant forskjell fra gjennomsnittet av preimmungruppen som målt ved enveis ANOVA med Kruskal-Wallis post-test. En ekstra Mann-Whitney-test som sammenligner midler til beskyttet og ikke-beskyttet er indikert med bar og resulterende p- verdi. c Data representert som en middel per frivillig med Mann-Whitney-testen som ble brukt for å avgjøre om den gjennomsnittlige% av spotten er forskjellig. For alle sammenligninger ** er p <0, 01, *** er p <0, 001 og **** er p <0, 0001

Full størrelse bilde

Vi testet deretter et sett av huIgG fra frivillige immunisert av klorokinprofylaxen med sporozoitter (CPS) -protokollen. 40 CPS administrerer fullt infeksiøse sporozoitter med myggbit til frivillige som samtidig mottar klorokin, noe som fører til fullstendig utvikling av leverstadiet, frigjøring av exoerytrocytiske merozoitter og etterfølgende eliminering av første syklus av blodstadiumsparasitter. CPS har vist seg å være svært effektiv, 6, 40, 41 og i denne forsøket beskyttet 5/8 frivillige fra CHMI. På grunn av prøvebegrensninger overførte vi bare 5 mg huIgG til hver FRG huHep-mus (3-5 mus / frivillig). Kontroller mottok enten preimmune huIgG eller bare fosfatbuffert saltvann (PBS). Det var ingen signifikant forskjell mellom preimmune huIgG og PBS-behandlede mus (tilleggsbilde S5A). I sammenligning med mus som mottok preimmune huIgG, reduserte immunhoIgG fra 1/5 beskyttede frivillige signifikant redusert leverstapel for parasitten med en annen ikke-signifikant redusert leverstadiebelastning til 36% av kontrollen (figur 6a). I motsetning til dette reduserte immunhoIgG fra ingen av de tre ikke-beskyttede frivillige parasittleverbyrden (figur 6a). Gruppering av mus basert på de som mottok immun-huIgG fra enten beskyttede eller ikke-beskyttede frivillige, som i figur 5b, viste at parasittleverstadiet av mus som mottok "beskyttet" immunhoIgG var lavere (68% av PBS) enn mus mottar enten preimmune huIgG (148% av PBS) eller "ikke-beskyttet" immunhoIgG (160% av PBS, figur 6b). Ved å gruppere de gjennomsnittlige parasitiske leverstadiebelastningene av mus som mottar huIgG fra en enkelt frivillig (en gjennomsnittlig / frivillig) som i figur 5c, ble det vist en lavere gjennomsnittlig pasientbelastning av pasienten etter passiv overføring av "beskyttet" huIgG (72% av PBS) sammenlignet med til "ikke-beskyttet" huIgG (166%, figur 6c). Igjen ble disse in vivo-resultatene ikke forutsatt ved in vitro-ISTI-analysen (tilleggsbilde S5B). Selv om det er begrenset av små utvalgsstørrelser, viser disse dataene at FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen kan brukes til å skille funksjonell fra ikke-funksjonelle polyklonale antistoffer hentet fra frivillige som er vaksinert med hele sporozoitter. Trender vi observerte foreslår også at denne modellen kan brukes til å etablere sammenhenger av beskyttelse basert på in vivo-funksjonen av antistoffer, men vil sannsynligvis kreve analyse av vaksineforsøk med større kohortstørrelser.

Antistofffunksjon i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen kan brukes som en sammenheng med beskyttelse. FRG huHep ble administrert 5 mg / mus av IgG samlet fra frivillige enten før ("Pre-Imm") eller 2 uker etter tre immuniseringer med 15 Pf- infiserte myggbitt under klorokinprofylax. Mus ble smittet av bitt av 50 Pf GFP_luc-infiserte mygg og leverenes byrde vurdert på dag 6 etter infeksjon. En parasitt leverstadiebelastning av mus ( n = 3-5 / frivillig) som mottar poolet preimmunisering eller individuell postimmunisering huIgG ble normalisert til mus som mottok et tilsvarende volum PBS (% av PBS). Datapunkter vises med stenger som gjennomsnittlig ± SEM for hver frivillig og gruppert av beskyttelsesstatus. Stjerner indikerer signifikante forskjeller fra preimmungruppen, målt ved enveis ANOVA med Kruskal-Wallis post-test. b Data i en, men arrangert slik at hver mus er plottet som et enkelt datapunkt og gruppert ved behandling med preimmun huIgG, immune huIgG fra en beskyttet frivillig eller immun huIgG fra en ikke-beskyttet frivillig. Over hver gruppe er gjennomsnittlig% av PBS samt stjerner som indikerer en signifikant forskjell fra gjennomsnittet av preimmun som målt ved enveis ANOVA med Kruskal-Wallis post-test. En ekstra Mann-Whitney-test som sammenligner midler til beskyttet og ikke-beskyttet er indikert med bar og resulterende p- verdi. c Data representert som en middel per frivillig med Mann-Whitney test som ble brukt for å bestemme om gjennomsnittlig% av PBS mellom mus som mottar beskyttet og ikke-beskyttet huIgG, er forskjellige. For alle sammenligninger * er p <0, 05 og ** er p <0, 01

Full størrelse bilde

Det endelige målet med malariovaksinasjon er steril beskyttelse, det vil si den komplette forebyggingen av parasittutgang fra leveren og påfølgende begynnelse av blodstadieinfeksjon. Måle reduksjon av leverstadiet som vist her vurderer ikke steril beskyttelse direkte. Vi adresserte dette ved å utføre passiv mAb-overføring etterfulgt av utfordring med fem Pf NF54-smittede myggbitt (antall infiserte mygg som ble brukt til CHMI) og brukt overgangen til blodstadieinfeksjon i stedet for parasittets leverbyrde som beskyttelsestemperatur. Ved denne lave utfordringsdosen kan reduksjoner i leverinfeksjon ikke studeres ved bioluminescerende bildebehandling, da luminescensen som er avledet fra denne mindre infeksjonen ligger innenfor deteksjonsgrensen uten antistoffbehandling. Mus i dette forsøket ble gitt 150, 50 eller 15 μg / mus av mAb 2A10 dagen før utfordring og injisert med humane røde blodceller på dag 6, 5 for å tillate parasittovergang i blodet. Den følgende dag (dag 7) ble perifert blod tatt og parasittdensitet målt ved Plasmodium 18S rRNA qRT-PCR. Ingen av musene behandlet med ikke-spesifikk mIgG ble beskyttet da alle mus hadde påviselig blodstadieinfeksjon. Imidlertid, hos mus som fikk 150 μg mAb / mus, var en dose som reduserte leveren byrde med 49% etter 50 myggbitt utfordring, 2/5 steril beskyttet mot 5 bite utfordringen. Reduksjon i dose til 50 μg / mus resulterte også i 2/5 mus beskyttet mens en enda lavere dose på 15μg ikke viste noen beskyttelse (figur 7a). Parasitt densititter i infiserte mus som mottok 150 μg mAb var 52 ganger lavere enn mIgG-behandlede mus ( p <0, 05). Ubeskyttede mus i 50 μg dosegruppe og 15 μg-gruppen hadde ubetydelige reduksjoner i parasittdensittene med henholdsvis 45 ganger og 4, 8 ganger. Vi bestemte også de sirkulerende mAb nivåene på utfordringstidspunktet i disse musene til henholdsvis 38, 9, 6 og 4, 1 μg / ml i henholdsvis 150, 50 og 15 μg / musene. I tillegg til å avgjøre reduksjoner i parasittleverbyrden etter passiv overføring, kan FRG-huHep-mus brukes til å måle steril beskyttelse ved hjelp av en naturlig myggbit-utfordring som tilsvarer CHMI ved hjelp av et qRT-PCR-endepunktsassay som også brukes i CHMI-studier. 34, 42, 43

FRG huHep / Pf utfordringsmodellen kan brukes til å vurdere steril beskyttelse. FRG huHep-mus ( n = 4-5 mus / gruppe) ble gitt indikert dose mAb 2A10 eller ikke-spesifikk mIgG 1 dag før utfordring ved bitt av fem Pf NF54-infiserte mygg. På dag 6, 5 ble musene injisert med 400 μl humane røde blodceller ved 70% hematokrit. På dag 7 ble perifert blod samlet og brukt til å vurdere tilstedeværelse av parasitemi ved hjelp av qRT-PCR. en kopi / ml parasitt 18S rRNA for hver indikert dose mAb 2A10 med negative mus plottet på x- aksen. Datapunkter er individuelle mus med stenger som representerer gjennomsnittlig ± SEM for hver gruppe. Som en negativ qRT-PCR-kontroll ble mGg-behandlede mus bløt før blodstadiumovergang på dag 6 ("150 μg mIgG D6"). Sammenligninger mellom mIgG og 2A10-behandlede grupper ble utført ved enveis ANOVA og Kruskall-Wallis post-test. Vesentlige forskjeller er angitt med stjerne hvor p <0, 05. b Serum ble samlet umiddelbart før utfordring og sirkulerende nivåer av mAb 2A10 ble målt ved ELISA. Hvert datapunkt er en mus med stenger som representerer middel ± SEM vist for hver gruppe og numerisk gjennomsnitt over hvert datasett

Full størrelse bilde

Diskusjon

Malaria vaksine kandidaten RTS, S som inneholder det imunodominante proteinet på sporozoittoverflaten, Pf CSP, har gjennomgått omfattende klinisk testing. Det har oppnådd beskjeden beskyttelse i fase III-studier som korrelerer med anti-CSP-antistoff titere og med CD4 + T-cellesponser. 3, 4- bevis for at antistoffer mot sporozoittantigener kan gi beskyttelse mot malaria hos mennesker. Dette bekreftes av flere tiår med studier i gnavermalariamodeller som benytter både aktiv immunisering og passiv overføring av mAbs som viser infeksjonsblokkerende aktivitet. 9, 33, 35, 44, 45, 46, 47 Videre fremkaller kliniske studier med immunisering med levende demperte sporozoitter anti-sporozoit antistoffer som hemmer sporozoitt infeksjon in vitro og in vivo, og i noen tilfeller disse antistoff titers og in vitro funksjon korrelere med beskyttelse. 1, 2, 6, 48 Targeting av leverstadier av parasittinfeksjon med T-celler gir også steril beskyttelse i gnavermalaria-modeller. 49, 50, 51 Det kliniske resultatet av T-cellebaserte malaravacciner har imidlertid vært lavt. 52, 53, 54

RTS, S-partiell effekt ga impulsen til å starte utviklingen av en andre generasjons subunit-vaksine som ikke bare øker kvaliteten, størrelsen og holdbarheten til anti-CSP-antistoffer, men inneholder også ytterligere antistoffmål som er i stand til å blokkere Pf- sporozoittinfeksjon. Imidlertid er disse anstrengelsene besvimt av mangelen på prekliniske modeller for naturlig Pf sporozoitt infeksjon levert av myggbit. Her optimaliserte vi et regime av Pf- infeksjon med myggbit i FRG huHep-mus som konsekvent og robust måler antistoff effekt med tilstrekkelige gruppestørrelser over sekventielle eksperimenter. Denne utfordringsstrategien viste seg også å være sensitiv nok til å måle reduksjoner i parasittleverstadiebelastningen etter passiv overføring av mAbs på en måte som var minst like følsom som qRT-PCR av infisert levervev. Vår noninvasive bioluminescerende avlesning var overlegen av en qRT-PCR-metode som unngår å behandle hele leveren, men økt følsomhet kan oppnås hvis hele lever-RNA-preparatet og qRT-PCR ble brukt. 6, 31, 55 I tillegg er bioluminescerende bildebehandling mindre tid og reagensintensiv som demonstrert av det faktum at parasittleverstadiet av 60 mus kan vurderes på bare ca. 1, 5 timer av en enkelt erfaren forsker.

FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen kan dermed brukes til nedvalgte mAbs basert på deres in vivo-funksjon før klinisk utvikling av enten mAb eller målrettet antigen. Faktisk var vi i stand til å diskriminere lavpresterende anti-CSP mAbs som klon 2A10 fra de som reduserer parasittleverstadiet av byrde med opptil 90%. Viktigst ble antistoff-effektene opprettholdt etter bytte til forskjellige mus-IgG-underklasser eller humant Fc. Dette er kritisk fordi mAb med humant Fc (dvs. de som er isolert fra vaksinerte frivillige) kan opprette en feilmatch mellom det humane antistoffet og FRG huHep-musens verten. Denne feilpasningen kunne skjule Fc-avhengig antistofffunksjon gitt den dårlige ytelse av humane Fc-regioner i mus. 38 Mens vi ikke så effekten av Fc-regionen på Ab-ytelse, testet vi bare mAbs som gjenkjenner CSP, og tidligere rapporter har også vist at Fc-regionen av anti-CSP-antistoffer er dispensabel. 44, 56 Således kan testing av ikke-CSP-spesifikke antistoffer vise forskjellige resultater i FRG huHep-musen hvis Fc-avhengige mekanismer eksisterer for andre antigenmål. Et slikt antistoff rettet mot a-galglykan er tungt Fc-avhengig i en gnavermalariamodell. 57 Da lignende antistoffer blir tilgjengelige for Pf, vil det være viktig å studere deres effekt i FRG huHep-mus. Likevel er FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen sensitiv, fleksibel og middels gjennomstrømning, noe som muliggjør funksjonell screening av både mAb og polyklonalt IgG.

In vivo-effekten av antistoffer mot enkle antigener, så som CSP, kan også testes i standardmus ved bruk av transgene gnavermalaria parasitter der det endogene antigen av interesse er blitt erstattet av Pf- ortologen. 16, 17, 18 Imidlertid er opprettelsen av disse parasittene komplekse og Pf- proteinet må komplementere det kognitive gnaver-malariaparasitproteinet for å gi en levedyktig parasitt. Dette blir stadig vanskeligere hvis kombinasjoner av antistoffer rettet mot flere proteiner er ønskelige da parasitter som bærer alle Pf- proteiner av interesse, må gjøres-krever flere runder av transgenese og øker sannsynligheten for ikke-levedyktige parasitter. Denne tilnærmingen er heller ikke egnet for bruk med polyklonale antistoffer med ukjente spesifisiteter, slik som de som er avledet fra hele sporozoittimmuniseringer som kan fremkalle tusenvis av forskjellige antigen-spesifisiteter. 58 Polyklonale huIgG isolert fra frivillige som er immunisert med hele sporozoitter, er testet for evnen til å forhindre leverstadieinfeksjon hos humane leverkimære mus 2, 6, 34, men ingen av disse studiene har nøye undersøkt omfanget av huIgG dose som er nødvendig for å bestemme beskyttelse eller ha de undersøkte antistofffunksjon in vivo som et korrelat av beskyttelse. Her bestemte vi oss for at et bredt spekter av polyklonale huIgG kunne brukes til å observere antistofffunksjon og en dose på 16 mg / mus er nødvendig for å rekapitulere nivåer av sirkulerende huIgG funnet i humant serum. Å kjenne disse kravene vil hjelpe til med å veilede samplingsplaner i kliniske studier hvor det er ønskelig å bestemme funksjonen av vaksinefremkalte antistoffer in vivo.

Vi undersøkte også polyklonal huIgG-aktivitet fremkalt etter hel sporozoittimmunisering in vivo som et korrelat av beskyttelse. Ved bruk av huIgG fra frivillige 6 måneder etter immunisering med den bestrålte PfSPZ-vaksinen, fant vi en svak korrelasjon mellom antistofffunksjon og beskyttelse av frivillige etter CHMI. Vi observerte et større antall beskyttede frivillige hvis huIgG medierte signifikant inhibering av leverstadieinfeksjon i FRG huHep-mus, men korrelasjonen mellom evnen til en persons huIgG for å redusere leverstapelbelastning og beskyttelse var ikke signifikant, hovedsakelig på grunn av en enkelt frivillig hvis huIgG resulterte overraskende i en økt levetrinnsbyrde. Dermed kunne vi ikke etablere et klart, prediktivt korrelat av beskyttelse i denne studien. Dette kan skyldes begrensninger i antistoff potens, den lille prøven størrelse eller det faktum at antistoffer kan spille en mindre rolle i beskyttelse i denne spesielle studien. Immunisering med bestrålede sporozoitter som PfSPZ har blitt vist i dyremodeller for å være sterkt avhengig av leverbo-cytotoksiske T-celler, 59, 60, og dermed etablering av et dominerende korrelat av beskyttelse ved bruk av kun antistofffunksjon kan være usannsynlig. Likevel legger våre data til bevis på at vaksinasjon med bestrålede sporozoitter fremkaller langvarig antistoffrespons som kan redusere antall sporozoitter som kommer til leveren, og er i samsvar med tidligere forskning. 2

I et ytterligere sett med eksperimenter ved bruk av polyklonale huIgG fra frivillige immunisert av CPS, observert vi også en svak korrelasjon mellom in vivo huIgG-funksjon og beskyttelse mot CHMI til tross for mindre robust antistofffunksjon hos enkelte frivillige. Prøvestørrelsene var igjen små, men huIgG fra beskyttede frivillige reduserte gradvis belastning av parasittleverstadiet i større grad enn ikke-beskyttede frivillige uavhengig av hvordan dataene ble analysert. Mens konklusjoner om beskyttelsesforhold i begge disse forsøkene skal tempereres, er det klart at vi var i stand til å oppdage forskjeller i antistofffunksjon mellom frivillige og mellom grupper med tydelig beskyttelsesstatus. Dette antyder at lignende studier ved bruk av større kliniske kohortstørrelser kan føre til generering av statistisk signifikante resultater og kunne være et kritisk verktøy for å identifisere korrelater eller beskyttelsesmekanismer i studier med flere antigener eller hele parasittvaksinasjoner. Selv om større studier ikke viser noen sammenhenger av beskyttelse med humoristisk immunitet, kan det hende at vitenskapene i immunsystemet formidler beskyttelse kan hjelpe med å veilede vaksinedesign eller levering for å best målrette immunforsvaret.

Det er viktig at vi også viser at FRG-huHep-mus kan brukes til å vurdere steril beskyttelse når en svært sensitiv Plasmodium 18 s rRNA qRT-PCR-analyse brukes til å oppdage blodstadieinfeksjon etter en lavere, fem myggbitt-utfordringsdose. Dette er den samme utfordringsdosen som brukes i CHMI-studier, og er det samme diagnostiske endpoint-analysen som brukes i slike studier. 19, 34, 42, 43 Alle mockbehandlede mus i vårt sterile beskyttelseseksperiment ble blod stadium positiv på dag 7. Steril beskyttelse er en binær avlesning med et begrenset dynamisk område. Imidlertid, mens steril beskyttelse ble observert ved de to høyeste dosene mAb 2A10, var det ingen i gruppen med laveste doser, noe som tyder på at denne modellen fortsatt er sensitiv mot antistoffdose og reflekterer total effektivitet. Når kombinert med evnen til å modulere sirkulerende mAb nivåer som vist her, vil det være mulig å bestemme konsentrasjonene av antistoff som kreves for å oppnå steril beskyttelse. Dette vil være nyttig for screening og nedvalg av antistoffer mot nye antigener eller epitoper og pre-CHMI-bestemmelsen av beskyttende nivåer av antistoffer som bør oppnås ved aktiv immunisering.

Endelig var en nøkkelfunn i alle våre eksperimenter at in vitro-ISTI-analysen ikke forutsier ytelse i FRG huHep / Pf GFP_luc-utfordringsmodellen. De mAbs vi testet alle utførte like godt in vitro, viste fremdeles store forskjeller i reduksjon av parasittleverstadiet byrden in vivo. In vitro-resultater for kliniske prøver forutslo også ikke noen trender i inhibering og faktisk over-estimert antistofffunksjon hos ikke-beskyttede frivillige. Dermed skal in vitro-analyser tolkes med forsiktighet og ikke brukes isolert for nedvalg av antistoffer / mål, og skal heller ikke brukes til å rangere antistoff effekt. Det er kanskje ikke overraskende at antistofffunksjon in vitro ikke nøyaktig forutsier funksjon in vivo, da sporozoitt bruker unike mekanismer for å bevege seg gjennom dermis, inn i sirkulasjonen, over leveren sinusformet barriere og til slutt inn i den tredimensjonale arkitekturen til leveren for utvikling av leverstadiet. 9, 10, 33, 35, 47 Alle aktuelle in vitro-analyser benytter infeksjon av hepatocytter i monokultur som ikke er representativ for sporozoites komplekse reise til leveren eller arkitekturen til målorganet. 26

FRG huHep-mus har fortsatt noen begrensninger for bruk i antistoffstudier da de mangler B, T, NK og NKT-celler. Dette utelukker deteksjon av antistoffvirkning hvis den avhenger av interaksjoner mellom Fc-regioner og Fc-reseptorene (FcR) på disse celletyper, selv om det til vår kunnskap ikke foreligger antistofffunksjon mot sporozoitter som er avhengig av interaksjon med disse celletyper . Likevel har FRG huHep-mus harbor antigen-presenterende celler som dendritiske celler og makrofager som kan fagocytose antistoffbundne sporozoitter. 61 Polymorfonukleære celler er også tilstede i disse musene 62 og kunne øke antistoff-mediert forebygging av leverinfeksjon. 57 Imidlertid vil alle beinmargavledede celler inneholde mus FcR som binder dårlig til humane Fc-regioner og kan begrense funksjonen til overført humant mAb eller huIgG. 38 Mens komplementets rolle i beskyttelse mot sporozoittinfeksjon er uklar, er 44, 56, 57 også uklart om disse musene kan fikse komplementet via den klassiske / antistoff-medierte banen med enten mus eller humane antistoffer. FRG huHep-mus gjør menneske C3 (data ikke vist), men det gjenstår å se om dette er funksjonelt i den klassiske komplementveien.

Til tross for sine begrensninger viser våre data at FRG huHep-mus er en svært relevant laboratoriemodell for å studere rollen som inhibitoriske antistoffer mot naturlig Pf- infeksjon. mAbs mot nye epitoper av eksisterende antigenkandidater eller helt nye kandidater kan screenes i FRG huHep-mus og vil derved bidra til å bestemme de som fungerer best in vivo. Dataene kan deretter bidra til å veilede rasjonell strukturbasert antigendesign samt nedvalgte antigenkandidater for å bevege seg inn i CHMI-studier ved bruk av enten passiv immunisering med mAbs eller aktiv immunisering med målantigenet. Humane leverkimære mus er også egnede modeller for å teste in vivo-funksjonen av polyklonale antistoffer med forskjellige eller ukjente spesifisiteter som de som er avledet fra vaksinering med komplekse immunogener, inkludert hele sporozoitter. Testing av disse antistoffene in vivo vil bidra til å identifisere korrelater eller bidragende beskyttelsesmekanismer som ikke kan oppfattes in vitro. Dermed kan modellen beskrevet her videre muliggjøre rasjonell optimalisering av beskyttende malaria vaksine kandidater og som sådan vil danne en bro til klinisk malaria vaksine utviklingsarbeid.

Materialer og metoder

FRG huHep mus utfordringer

Humane hepatocytter donor-matchede FRG huHep-mus (både mannlige og kvinnelige, > 4 måneder) ble kjøpt fra Yecuris, Inc. Repopulering av humane hepatocytter ble bekreftet av serumalbuminnivåer, og bare dyr med serumalbuminnivåer> 3 mg / ml ble brukt. For passiv overføring ble mus injisert intravenøst ​​eller intraperitonealt med indikert dose anti- Pf CSP monoklonalt antistoff eller huIgG 16-24 timer før utfordring. mAbs ble gitt av PATH Malaria Vaccine Initiative hvor mAb1 er klon 3C1 og mAb2 er klon 2H8. For myggbete utfordring ble Anopheles mygger infisert med Pf uttrykker GFP-luciferase eller wild type NF54 generert som tidligere beskrevet. 36 Mygginfeksjon ble kvantifisert ved midgut-disseksjon på dag 7-10 etter blodmel og ble brukt bare hvis> 50% mygg inneholdt et gjennomsnitt på> 10 oocytter / midgut. Alle kvalifiserende mygg ble deretter samlet og omfordelt til bur med ~ 50 mosquitos / mus med opptil 250 mygg. For fem myggbitt utfordring ble antall mygger / mus justert for å gjenspeile infeksjonsprevalens (f.eks. Hvis 90% mygg ble smittet, ble i alt 28 mosquitos lagt til et bur for å infisere fem mus). Mus, i grupper på opptil fem, ble deretter anestetisert med isofluran og plassert på en maske som dekker myggbeholderen under isofluranbedøvelse via nesekegle. Mygg ble deretter tillatt å mate i 10 minutter med løft av mus hvert minutt for å oppmuntre probing og injeksjon av sporozoites i stedet for blodtilførsel. Etter 10 minutter ble musene returnert til normal aktivitet. På dag 6 etter infeksjon (topp av leverstadiebelastning) ble musene avbildet for leverstadiebelastning ved bruk av bioluminescens og IVIS-bildebehandling som tidligere beskrevet. 33, 63 Kort fort ble mus injisert intraperitonealt med 100 ul Rediject D-luciferin (Perkin Elmer) og avbildet etter 5 minutter i en fem minutters eksponering. Liver stage burden was assessed by placing an identical region of interest around the liver of each mouse and measuring total flux in pixels/second (p/s). Liver stage burden of all mice was normalized by setting the mean of the negative control group that received non-specific, species-matched IgG or pre-immune huIgG to 100% within each bite experiment. Liver stage burden was alternatively assessed in a subset of experiments by Plasmodium 18S rRNA RT-PCR normalized to hApoA1 mRNA, as previously reported. 6, 64

For assessment of sterile protection, mice were iv-injected with 400 μL of human red blood cells at 70% hematocrit in RPMI 6.5 days post challenge. On day 7, mice were bled via the retroorbital plexus and exactly 50 μL of blood was placed into 1 mL of Nuclisens EasyMag buffer (bioMérieux) and stored at −80 °C until extraction. Total RNA was extracted using an EasyMag instrument (bioMérieux) as described. 43 Plasmodium 18S rRNA qRT-PCR was performed as described 65 although newly described pan- Plasmodium 18S rRNA-specific reagents were used herein. 66 Mice were considered positive if qRT-PCR was above the undetectable qRT-PCR signal obtained on day 6 post challenge.


ELISA for serum mAb concentration

Mice were bled via retroorbital plexus immediately prior to challenge and blood allowed to clot in BD serum separator tubes for 2 h. Serum was separated by centrifugation at 14, 000× g for 2 min. For ELISA, Costar EasyWash (Corning) were coated with 2 μg/mL in coating buffer as previously described. 34 Plates were then blocked with dilution/blocking buffer (0.05% Tween-20, 6% bovine serum albumin in PBS) for 1 h at room temperature. After washing, 50 μL of serum samples were applied in duplicate at 1:160 and 1:320 dilutions in dilution/blocking buffer. A standard curve was generated using eight two-fold dilutions of 2A10 starting at 625 ng/mL in dilution/blocking buffer and 50 μL applied in duplicate with samples. Standards and serum samples were incubated at room temperature for 2 h. After washing, HRP-conjugated anti-mouse IgG was applied at a 1:5000 dilution for 1 h at room temperature. Plates were developed with SureBlue™ TMB reagent for 4 min and stopped with SureBlue™ Stop reagent before reading absorbance at 450 nm. Serum concentrations were interpolated using a 4-parameter non-linear regression of the standard curve.


Etikkerklæring

All animal procedures were conducted in accordance with and approved by the Center for Infectious Disease Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) under protocol SK-16. The Seattle Biomed IACUC adheres to the NIH Office of Laboratory Animal Welfare standards (OLAW welfare assurance # A3640-01).


Preparation of monoclonal and polyclonal antibodies

Monoclonal antibody 1 (mAb 1, clone 3C1) was prepared as previously described. 2 Monoclonal antibody 2 (mAb 2, clone 2H8) was generated under a Gennova-PATH Malaria Vaccine Initiative collaborative program by immunization of mice against full length Pf CSP produced by Gennova. Hybridoma clone 2A10 specific for Pf CSP was obtained from MR4 and ProMab Biotechnologies, Inc. performed antibody production and purification. For IgG isolated from human serum, samples were prepared as recently published. 2 Briefly, serum was used for extraction of IgG using protein G columns (GE Healthcare Life Sciences) following manufacturer's protocol and concentrated using Amicon Ultra-15 centrifugal units (EMD Millipore) to 20–25 mg/mL in PBS.


In vitro inhibition of sporozoite invasion and traversal assay (ISTI)

Antibodies and IgG were tested at indicated concentrations in ISTI following previously published methods. 67, 68 Briefly, freshly dissected Pf sporozoites were incubated with antibodies at indicated concentrations in DMEM media containing 10% heat-inactivated FBS supplemented with glutamine, penicillin/streptomycin, Fungizone and FITC-dextran for 15 min a 37 °C. Sporozoites and media were then added to HC04 cells (ATCC, Inc.) plated 1 day prior at 10 5 cells/well in a 96-well plate at an MOI of 0.3 (sporozoites:HC04 cells). Plates were then spun at 500× g for 3 min and incubated for 90 min at 37 °C. Cells were then washed, trypsinized and transferred to a new 96-well plate where they were fixed and permeabilized using BD cytofix/cytoperm (BD Biosciences). Cells were then stained with anti-CSP mAb conjugated to AlexaFluor-647 and analyzed by flow cytometry using a BD LSRII and FloJo analysis software. Cells were considered “invaded” if they were CSP-positive and “traversed” if they had taken up FITC-dextran due to cell membrane wounding. Antibody-treated wells were normalized to either species-matched non-specific IgG for mAbs and to pooled pre-immune IgG at equivalent concentrations. Anti-CSP mAb 2A10 was included at 10 μg/mL in each assay as a positive control for inhibition.


Statistisk analyse

Relevant statistical tests are indicated in figure legends and were conducted using GraphPad Prism 6.0 for Mac. Significant results are indicated in figures with relevant p values indicated by “*” in each figure legend. Comparisons not indicated in figures were non-significant with p > 0.05.


Datatilgjengelighet

Dataene som støtter resultatene av denne studien er tilgjengelig fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.

bekreftelser

We would like to thank Moriya Tsuji (ADARC/Rockefeller University) for providing mAb 3C1 and the PATH Malaria Vaccine Initiative/Gennova for providing mAb 2H8 as well as the 3C1 and 2H8 isotype variants. We would also like to thank the Center for Infectious Disease Research vivarium staff for their expertise in animal care and Yecuris, Inc. for the coordination of animal production and delivery. This work was funded by the Bill and Melinda Gates foundation (Investment ID: 24922), MVI/PATH (grant # GAT.0888-30-01259780-COL) and NIH grant # F32 AI 114113.

Elektronisk tilleggsmateriale

  1. Supplerende Figur 1

  2. Supplerende figur 2

  3. Supplerende figur 3

  4. Supplerende figur 4

  5. Supplerende figur 5

  6. Supplerende Figur Legends

Anbefalt Redaksjonens