Anonim

Temaer

  • Anvendt immunologi
  • CRISPR-Cas9 genom redigering
  • Uttrykkssystemer

Abstrakt

Hybridomer, fusjoner av primære mus B-celler og myelomer, er stabile, hurtig-prolifererende cellelinjer som er mye brukt for antistoff-screening og produksjon. Antistoff-spesifisitet av en hybridomklon bestemmes av immunoglobulinsekvensen av den primære B-celle. Her rapporterer vi en plattform for rask omprogrammering av hybridom-antistoff-spesifisitet ved immunogenomisk konstruksjon. Her bruker vi CRISPR-Cas9 til å generere dobbeltstrengede brudd i immunoglobulin-loci, noe som muliggjør sletting av den native variable lette kjeden og erstatning av den endogene variable tungkjede med et fluorescerende reporterprotein (mRuby). Nye antistoffgener blir introdusert ved Cas9-målretting av mRuby for erstatning med en donorkonstruksjon som koder for en lettkjede og en variabel tungkjede, noe som resulterer i fullstendig antistoffuttrykk. Siden hybridomas overflate uttrykker og utskiller antistoffer, blir omprogrammerte celler isolert ved hjelp av strømningscytometri og cellekultur-supernatant brukes til antistoffproduksjon. Plug-and- (dis) play hybridomas kan omprogrammeres med bare et enkelt transfeksjon og screeningstrinn.

Introduksjon

Siden starten for snart 40 år siden 1, har hybridomer blitt en av de mest utnyttede plattformene for monoklonalt antistoff (mAb) screening og oppdagelse. Hybridomer genereres ved fusjonen mellom primære B-celler (typisk fra immuniserte mus) og myelom (plasmacytom) celler, som resulterer i immortaliserte, raskt prolifererende stabile kulturer av antistoffproducerende cellelinjer, som muliggjør screening, oppdagelse og produksjon av mAbs 2 . Ved å ha både B-celle og plasma-celle-immunoglobulin RNA-spleisveier 3, er mange hybridomkloner i stand til samtidig å produsere både membran-assosierte og sekretoriske immunglobulin-tunge (IgH) transkripsjoner, hvilket fører til overflateekspresjonen og utskillelsen av antistoffer 4 .

I et typisk forskningslaboratorium er den vanligste tilnærmingen til rekombinant antistoffuttrykk gjennom transient plasmidtransfeksjon av pattedyrcellelinjer. Selv om forbedringer i plasmiddesign og -levering har ført til systemer med høyt forbigående uttrykk 5, betyr det konstante behovet for å produsere og transfektere plasmid at en stabil cellelinje tilnærming ville være fordelaktig når konsistent antistoffproduksjon er ønsket. Ovarieceller fra kinesisk hamster er det overveiende stabile cellelinjesystemet for industriell skala produksjon av mAbs, men hybridomer har også en lang historie i bruk i produksjonskapasiteter. Dette skyldes at hybridomfusjonspartnerne myelomer er avledet fra plasmaceller, som er terminalt differensierte B-celler som har en omformet transkripsjonsprofil og cellulær fysiologi som gjør det mulig for dem å utskille store mengder antistoffprotein 6 . For eksempel har plasmacytomcellelinjerne NS0 og Sp2 / 0-Ag14 (som ikke uttrykker endogene immunglobuliner) blitt brukt i stor utstrekning for generering av mAb-produserende cellelinjer, inkludert storskala produksjon av flere mAb-terapeutiske midler 7, 8 . Stabil cellelinjegenerasjon bygger imidlertid på tilfeldig genomisk integrasjon av transgene 9 . Forstyrrende faktorer, som for eksempel flere integrasjonssteder, gensynkronisering, kromatinstruktur og ubalansert produksjon av antistoffer tung og lette kjeder, resulterer i en heterogen populasjon hvor en lang og arbeidskrevende utvalgsprosess er nødvendig. Dette betyr flere måneder, og opptil 1 år kreves vanligvis før valget av en optimal stabil klon 10 . Derfor er stabil cellelinjegenerering vanligvis utilgjengelig for akademiske og små til mellomstore enheter. En metode for å redusere innsatsen og tiden som er tatt for å generere slike cellelinjer ved målrettet integrasjon av antistofftransgener ville være sterkt fordelaktig.

Få eksempler på målrettet genomisk modifikasjon av hybridomer er rapportert. I utgangspunktet brukte disse studiene hybridomer som modellpattedyrsystemer for å studere grunnleggende mekanismer for DNA-dobbeltstrenget pause (DSB) -reparasjon 11, 12, 13 . I to bemerkelsesverdige eksempler ble målrettet integrasjon på immunoglobulin-locus anvendt for å gjenopprette antistoffproduksjon i en IgG-mangelaktig mutantcellelinje 14 eller for omdannelsen av IgH-konstantområdet fra mus til menneske 15 . Selv om disse studiene viste potensialet for å genomisk modifisere hybridomer, stod de på klassiske metoder for genmålretting, som har en tendens til å være ineffektiv og krever multistep utvalgssystemer (for eksempel neo-HSV-tk) 16 . Fremveksten av nukleaser med programmerbar målrettespesifisitet, spesielt CRISPR-Cas9-systemet, har ført til en revolusjon i genomredigeringsapplikasjoner 17, 18, 19 . I et nylig eksempel ble CRISPR-Cas9 brukt til å generere DSB i immunoglobulin-konstant regionen av B-cellelinjer, hvorved rekombinasjon av klassebryter fremmes eller for å knocke ut den IgH-konstante regionen for antistofffragmentekspresjon 20 . Imidlertid har hittil ikke blitt beskrevet utvikling av en generaliserbar metode som er i stand til å utveksle antistoff-spesifisitet i hybridomer.

Her genererer vi en plattform for rask omprogrammering av antistoff-spesifisitet i hybridomer ved presis immunogenomteknikk. Vår tilnærming er sentrert på å utnytte CRISPR-Cas9 for å generere målrettede DSB i immunoglobulin-loci av hybridomer. Som et første skritt målretter vi IgH-locuset og utnyttet homologertilt reparasjon (HDR) for å erstatte den endogene variable tungkjede (VH) med en donorkonstruksjon som har et fluorescerende reporterprotein, mRuby 21 . Deretter slettes den omlagrede variabellampen (V L ) av immunoglobulin kappa-lyset (IgK) -stedet ved bruk av Cas9 og to guiden RNA (gRNA) -steder som retter seg mot sekvenser som flankerer denne regionen. Med endogent antistoffuttrykk slått ut, blir en ny antistoffkoding sekvens innført i IgH-locus ved bruk av CRISPR-Cas9 for å målrette og erstatte mRuby via HDR. Det nye antistoffet er kodet av et syntetisk antistoff-område (sAb), som består av en V L og konstant kappa lettkjede (C k ), et selvspaltende 2A ribosomalt hoppepeptid og en VH. Dette muliggjør ekspresjon av full lengde IgK og IgH gjennom et enkelt messenger RNA (mRNA) transkript 22, og krever integrering av bare en enkelt donorkonstruksjon i IgH-lokalet. Siden den startende hybridomklonoverflaten uttrykker antistoff, er vi i stand til å isolere celler som uttrykker sAb ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS), og antistoffsekresjon og spesifisitet blir deretter verifisert i sorterte celler. Til slutt demonstrerer vi den hurtige, enkle og generaliserbare naturen til denne tilnærmingen ved å erstatte vår hybridom mububincellelinje med flere ekstra sAb-konstruksjoner. Derfor etablerer vi en plug-and- (dis) play (PnP) hybridomplattform, hvor antistoff-spesifisitet konsekvent omprogrammeres ved CRISPR-Cas9-målretting av immunoglobulin-lokus. Ved å bruke bare et enkelt transfeksjons- og screeningstrinn, er vi i stand til å generere cellelinjer som gir samtidig antistoffoverflatekspresjon og sekresjon.

resultater

Karakterisering av immunogenom redigering i hybridomer

Vi brukte en hybrid-cellelinje med foreldre-type (WT) med kapasitet til å overføre ekspres og secrete antistoffer (klon WEN1.3, utledet fra tidligere musestudier av virusinfeksjon, tilleggs tabell 1). IgK- og IgH-loci ble sekventert og CRISPR-Cas9-målingssteder ble identifisert (tilleggsbilde 1). Protospacer tilstøtende motiv (PAM, 5'-NGG) av S. Pyogenes Cas9 og kandidat-gRNA ble valgt (tilleggstabell 2). For IgH-locuset ble gRNAer valgt å målrette den introniske regionen mellom lederpeptidet og VH-genet og den introniske regionen umiddelbart nedstrøms for JH- segmentet ( J4 i VH i WEN1.3). I IgK-lokalet valgte vi gRNA-steder i lederpeptidregionen og den introniske regionen nedstrøms JK-segmentet ( J4 i V L av WEN1.3). GRNAene ble klonet inn i CRISPR-Cas9-plasmidet pX458 (pSpCas9 (BB) -2A-GFP), som muliggjør deteksjon av Cas9 via ekspresjonen av grønt fluorescensprotein (GFP) 23 . Hybridomceller ble transfektert (nukleofeksjonsprotokoll, se avsnittet "Metoder") med pX458 og strømningscytometri avslørte en klar populasjon av pX458-positive kloner, som senere ble isolert av FACS (tilleggsbilde 2a). Effektiviteten av Cas9-målretting i IgH- og IgK-loci ble evaluert ved hjelp av Surveyor-analyser, som kvalitativt måler effektiviteten av DSB-generasjon som et resultat av reparasjon gjennom ikke-homolog sluttenhet (NHEJ) 23 . Vi fant variable nivåer av Cas9-effektivitet for alle de testede gRNA-stedene, og i noen tilfeller var det tegn på betydelig NHEJ (tilleggsbilde 2b, c). På grunnlag av deres høye aktivitet, valgte vi gRNA-E for IgH-locuset (205 bp nedstrøms for JH- regionen) og etterfølgende eksperimenter rettet mot immunoglobulin-loci av WT-celler, og to gRNAer (gRNA-F, -H) for IgK (rettet mot lederområdet og intron nedstrøms for JK) (tilleggsbilde 2b, c).

Generering av en PnP-mRuby hybridomcellelinje

Det første trinnet i å generere en PnP-hybridomplattform besto av å erstatte VH-regionen av WT-celler med et fluorescerende reporterprotein ved bruk av CRISPR-Cas9-måling (figur 1a). En HDR-donorkonstruksjon ble utformet for å inkludere det røde fluorescerende protein mRuby flankert av homologiske armer som var i samsvar med de introniske segmentene som flankerte leder- og VH-regionen i WT-celler (figur 1b og tilleggsbilde 3). Den 5 'homologi armen forlenget 732 bp og avsluttet umiddelbart før lederområdet; 3'-homologearmen startet før slutten av J-regionen og utvidet 711 bp. WT-cellene ble elektroporert med pX458 (med gRNA-E) og mRuby HDR-donorkonstruksjonen (linearisert format). Ved ~ 48 timer etter transfeksjon ble Cas9 + -celler (2A-GFP + ) isolert ved FACS og utvidet i kultur. Ved ~ 10 dager etter transfeksjon var en klar populasjon av mRuby + -celler synlig; denne populasjonen ble sortert og utvidet (tilleggsbilde 4). Som forventet var mRuby + -celler overveiende negative for ekspression av tungkjede av antistoff. Etter en ekstra bulk-sortering ble sortering og utvidelse av høy renhet utført for å oppnå en svært ren populasjon (figur 1c). For å vurdere om mRuby integrert sted spesifikt i IgH-locuset, ble genomisk PCR utført med primere utformet for å anneale innenfor 5'-homologarmen og nedstrøms (utenfor) av 3'-homologarmen (figur 1d og tilleggsbilde 4c). Størrelsen på PCR-produkter i mRuby + -celler var 1 776 bp (sammenlignet med 1 514 bp i WT-celler), som korresponderte med den forventede størrelsen for korrekt integrasjon av HDR. Sanger-sekvensering av disse produktene bekreftet at mRuby + -genet faktisk hadde erstattet endogen leder- og VH-regioner i IgH-locuset (tilleggsbilde 3). MRuby + klonen 1E9 ble valgt for IgK-teknikk-trinnet.

( a ) Skjematisk viser vildtype (WT) hybridomceller som uttrykker antistoff som vil bli omdannet til plug-and-dis-play (PnP) -mRuby-celler. ( b ) vist er målrettingen av WT IgH genomisk locus med følgende merknader: ledersekvens (L, gul), mRNA-spleisningssteder (SS, oransje), VH (blå) og IgG konstant tung region ( CH1, mørk blå). Cas9 gRNA-E målstedet (svart) er i intronen mellom V H og C H 1. Donorkonstruksjonen består av mRuby-gen med en stoppkodon flankert av to homologarmarmer (HA) på 732 og 711 bp. PnP-mRuby IgH-locuset genereres ved elektroporering av WT-celler med CRISPR-Cas9-plasmid og donorkonstruksjon, hvilket vil resultere i HDR-basert utveksling av VH-regionen med mRuby. ( c ) Flowcytometri punktplot viser at WT-celler utelukkende er IgH-positive og mRuby-negative, hvor PnP-mRuby-celler er utelukkende mRuby-positive og IgH-negative. ( d ) PCR ble utført på genomisk DNA fra WT og PnP-mRuby-celler ved bruk av en fremre primer i 5'H og revers primer som er ekstern av 3'-HA. Agarosegel viser forventet størrelse på bånd. Bandet fra PnP-mRuby-celler ble ekstrahert og Sanger-sekvensering bekreftet mRuby-utveksling av VH-regionen (se tilleggs-figur 3). ( e ) Vist er målretting av WT hybridom IgK-locus med følgende merknader: V L (lyseblå) og IgK konstant lysområde (C K, mørk blå), andre merknader samme som vist i a . To gRNA-målsteder (svart) benyttes for å slette V L- regionen. ( f ) Flowcytometri punktplot viser at WT-celler er sterkt IgH-positive og IgK-positive, hvor PnP-mRuby-celler utelukkende er IgH-negative og IgK-negative. ( g ) PCR ble utført på genomisk DNA fra WT og PnP-mRuby-celler ved bruk av en fremre primer 5 'av gRNA-F-stedet og revers primer 3' av gRNA-H-stedet. Agarosegel viser den forventede størrelsen på båndet for WT-celler og nesten ingen amplifikasjonsprodukt for PnP-mRuby-cellelinjen. Gjennom denne figuren tilsvarer WT-celler klonen WEN1.3 og PnP-mRuby-celler korresponderer med klon 1E9.C3 (for ytterligere detaljer, se Supplerende tabell 1).

Full størrelse bilde

Vi har som mål å gjøre mRuby + -cellelinjen mangelfull for lettkjedeuttrykk ved å slette V L- regionen i IgK-locuset (figur 1a). I denne forbindelse utnyttet vi muligheten til multiplexet målretting med CRISPR-Cas9 (ref. 24). Vi brukte to gRNAer som målrettede områder i lederregionen (gRNA-F) og 3 'av JK-segmentet (gRNA-H) (figur 1e). MRuby + klonen 1E9 ble samtransfektert med pX458-plasmider som koder for begge gRNA, og cellene ble sortert for Cas9 (2A-GFP) -uttrykk og utvidet for ytterligere karakterisering. Selv om erstatning av VH med mRuby burde ha tilsvarende ført til manglende evne til lett kjede til å samle og uttrykke på overflaten av celler, observerte vi fortsatt bakgrunnsuttrykk av IgK (Supplementary Fig. 5a). Dette ga oss hensiktsmessig en fenotypisk markeringsmarkør for celler som sannsynligvis ville ha hatt sitt V L- område slettet, og derfor brukte vi FACS til å isolere IgK - celler. I likhet med tidligere har vi utført single-cell sortering, utvidelse og karakterisering. Flere kloner viste et klart fravær av IgK- og IgH-overflateekspresjon, mens man opprettholde mRuby-ekspresjon (figur 1f). Genomisk PCR i IgK-lokalet bekreftet et klart fravær av V L, som bekrefter deletjon av denne regionen (figur 1g og tilleggsbilde 5b). Vi valgte klone 1E9.C3 for fremtidige eksperimenter; For enkelhets skyld er denne cellelinjen heretter referert til som PnP-mRuby (tilleggstabell 1).

Omprogrammering av PnP-mRuby-celler for å uttrykke et nytt antistoff

For å omprogrammere en ny antistoff-spesifisitet i hybridomaceller ble PnP-mRuby brukt som startplattformcellelinje. Tilstedeværelsen av et konstitutivt uttrykt reportergen i IgH-lokalet ga en gunstig positiv-negativ fenotype for screening, idet mRuby kunne erstattes med et nytt antistoff og detektert ved hjelp av flytcytometri. Som tidligere identifiserte og identifiserte vi først og fremst gRNA-områder (gRNA-J og gRNA-K) som målrettet mot mRuby-genet ved elektroporering av PnP-mRuby-celler med pX458.2 (pSpCas9 (BB) -2A-BFP, se 'Methods' seksjon) og undersøkelsesanalyser (tilleggsbilde 6). For å gjeninnføre et nytt fullstendig antistoff, samtidig som man unngår målretting av både IgK- og IgH-lokalet, brukte vi en tilnærming som tillot både full lengde lys og tungkjedeuttrykk fra den native IgH-promotoren som en enkelt transkripsjon (figur 2a). Dette ble oppnådd ved å designe en sAb-givermaler med følgende hovedelementer (5 'til 3'): (i) V L- gen (foran et ledende og intronisk segment); (ii) CK- genet; (iii) et selvspaltende 2A-peptid kombinert med et furin-spaltningssted 22, 25 ; (iv) VH-genet (ført av leder og intron-region) (figur 2b og tilleggsbilde 7a). SAb-konstruksjonene ble klonet inn i vektorer med lignende homologarmarmer som ble brukt for integrering av mRuby i IgH-lokalet (en forkortet versjon av 3'-homologarmen på 697 bp ble brukt), noe som gjorde dem kompatible for HDR med PnP-mRuby-celler. For full lengde IgG å uttrykke og samle riktig, må mRNA fra et integrert VH-gen splitte seg med den første exon av IgH-konstant tung (CH1) -regionen (figur 2c og tilleggsbilde 7b). Vi inkluderte dette spleisstedet i 3 'homologarmen av donorkonstruksjonen, og ga således en fenotypisk seleksjonsmarkør av IgH-ekspresjon for korrekt sAb-innføring. Cellene som gjennomgår HDR-utveksling kan også isoleres ved positiv-negativ seleksjon, da mRuby og IgG-ekspresjon bør være gjensidig eksklusiv.

( a ) Skjematiske viser PnP-mRuby-celler som uttrykker mRuby, vil bli omdannet tilbake til hybridomer som uttrykker et nytt antistoff via et syntetisk antistoff (sAb) -konstruksjon. ( b ) Vist er utformingen av sAb-donorkonstruksjonen (for enkelhets skyld er introner blitt ekskludert, for fullstendige sekvensdetaljer, se tilleggsbilde 7). ( c ) Vist er PnP-mRuby IgH-locuset hvor gRNA-J målstedet (svart) er i mRuby-genet. PnP-mRuby-celler transfektert med CRISPR-Cas9-plasmid og sAb-giver vil resultere i HDR-drevet genomisk erstatning av mRuby. Det nye antistoffet vil da bli uttrykt fra et enkelt mRNA-transkripsjon. ( d ) Flowcytometri punktplot viser de forskjellige populasjonene som oppstår etter transfeksjon av PnP-mRuby med CRISPR-Cas9 plasmid og sAb donor [Hen egg lysozym 23 (HEL23)]. Cellene som var positive for IgH-uttrykk ble sortert. ( e ) Flowcytometri punktplot viser initial populasjon av PnP-mRuby-celler og resulterende celler (PnP-HEL23) fra sortert IgH-positiv populasjon i d, som nå er sterkt positive for IgH og IgK-ekspresjon. ( f ) Graf viser sandwich ELISA-resultater (fange anti-IgK, primær deteksjons-anti-IgH) på hybridomkultur-supernatant, PnP-HEL23 viser IgG-sekresjonsnivåer som ligner på WT. For hver prøve ble fire tekniske replikater analysert og en logaritmisk kurve med fire parametere ble tilpasset dataene ved ikke-lineær regresjon. Data presenteres som gjennomsnittet og feillinjene indikerer standardavvik. ( g ) PCR ble utført på genomisk DNA av WT, PnP-mRuby, PnP-HEL23-celler ved bruk av primere vist i c . Agarosegel fra genomisk PCR viser den forventede båndstørrelsen i PnP-HEL23. ( h ) RT-PCR fra mRNA ble utført med primere vist i c og resulterer i et synlig bånd av den riktige størrelsen presentert bare i PnP-HEL23. Bandene fra PnP-HEL23 ble ekstrahert og Sanger-sekvensering bekreftet korrekt integrasjon av PnP-sAb-konstruksjonen (se tilleggs-figur 7). Gjennom denne figuren tilsvarer WT-celler klon WEN1.3, PnP-mRuby-celler korresponderer med klon 1E9.C3, og PnP-HEL23-celler korresponderer med klon Y (for ytterligere detaljer se Supplementell tabell 1).

Full størrelse bilde

Vi validerte først CRISPR-Cas9 målretting og erstatning av mRuby med et sAb basert på et mAb med spesifisitet for modell antigen høne-egglysozym (HEL, mAb-klon HEL23 avledet fra plasmaceller fra en immunisert mus, upubliserte resultater). PnP-mRuby-celler ble transfektert med pX458.2 (gRNA-J) og sAb-HEL23 lineær HDR-donor. Etter sortering og utvidelse av Cas9 + -celler (2A-BFP), observerte vi en klar populasjon av IgH + mRuby - celler (figur 2d). Også tilstede var mRuby + IgH- og dobbelt negative celler. IgH + mRuby - cellene ble masse-sorterte, utvidet og omfattende karakterisert (PnP-HEL23). Vi overflate merkede omprogrammerte celler for IgK og IgH ekspression og fant dem å være nesten utelukkende positive for IgG overflateuttrykk (figur 2e). For å bestemme antistoffsekresjonsnivåer utførte vi sandwich-enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISAer) på kultursupernatanter og fant PnP-HEL23 uttrykt IgG, om enn i lavere nivåer sammenlignet med de startende WT-cellene (figur 2f). Genomisk PCR i IgH-lokalet (ved hjelp av en fremadrett i 5'-homologarmen og omvendt primer utenfor 3'-homologarmen) resulterte i produkter på 2, 481 bp, den forventede størrelsen for korrekt HDR-innsetting av full lengde sAbs omfattende V L -C K -2A-VH (figur 2g). PCR med revers transkripsjon (RT-PCR) på mRNA ved bruk av en fremre primer i V L- regionen og revers primer på C H 1 resulterte også i et bånd av riktig størrelse (1, 287 bp), hvilket tyder på korrekt spleising av VH med C H 1 transkripsjoner (figur 2h). Sanger-sekvensering på PCR-produkter avledet fra både genomisk DNA og mRNA-bekreftet sAbs hadde riktig erstattet mRuby i IgH-locuset (tilleggsbilde 7). Endelig bekreftet vi ved flowcytometri og ELISA at både overflaten uttrykt og utskilt antistoffer fra PnP-HEL23-celler beholdt bindingsspecifikitet for HEL-antigenet (figur 3). Vi bekreftet også med uavhengige eksperimenter at transfeksjon av PnP-mRuby-celler med pX458.2 som inneholder gRNA-K og en sirkulær sAb-plasmiddonor (i stedet for den lineære versjonen), førte til HDR og antistoffuttrykk (tilleggsbilde 8).

( a ) Flowcytometrihistogram viser omprogrammerte hybridomceller (PnP-HEL23) overflate-ekspress antistoff som er spesifikt for kognitt antigen høne-egglysozym (HEL). ( b ) ELISA-data viser at PnP-HEL23-celler utskiller antistoff spesifikt for HEL. Én teknisk replikat ble analysert for kontrollprøvene (WT og PnP-mRuby) og to replikater for PnP-HEL23 cellelinjen. En logaritmisk kurve med fire parametere ble tilpasset dataene ved ikke-lineær regresjon. Data presenteres som gjennomsnittet og feillinjene indikerer standardavvik. Gjennom denne figuren tilsvarer WT-celler klon WEN1.3, PnP-mRuby-celler korresponderer med klon 1E9.C3, PnP-HEL23-celler, korresponderer med klon Y (for ytterligere detaljer, se tilleggs tabell 1).

Full størrelse bilde

Reproducerbar generasjon av antistoff stabile cellelinjer

For å demonstrere generaliserbarheten til plattformen vår, genererte vi PnP-celler med flere flere antistoffer. Vi konstruerte tre flere sAb-givere, og holdt samme generelle format som HEL23. Vi brukte variable regioner fra følgende mus mAbs: HyHEL10, en velkarakterisert klon med spesifisitet mot HEL 26 ; 2G4 og 4G7, antistoffer med spesifisitet til Ebola virus (EBV) glykoprotein (murine versjoner av mAbs brukt i den terapeutiske medisinske kandidat ZMapp) 27 . PnP-hybridomer ble elektroporert med pX458.2 (gRNA-J) og respektive sAb-donorer fulgt av et første screeningstrinn for Cas9-ekspresjon (2A-BFP). Utvidelse av sorterte celler avslørte nærvær av gjensidig eksklusive populasjoner som uttrykker IgH eller mRuby (figur 4a), hvilket indikerer positiv omprogrammering med sAb-donorer. Etter to sorteringstrinn for IgH + -uttrykk (for PnP-2G4-EBV og PnP-4G7-EBV besto det andre sorteringstrinnet av dobbeltgating på IgH + og IgK + -uttrykk), alle tre cellelinjer var jevnt positive for både IgH og IgK-ekspresjon (figur 4b).

( a ) Flowcytometri dot plots viser PnP-mRuby celler etter transfeksjon med CRISPR-Cas9 plasmid og forskjellige PnP-sAb donor konstruksjoner som koder for antistoffer spesifikt for HEL eller Ebola virus glykoprotein (EBV). Cellene ble sortert for IgH-ekspresjon. ( b ) Flowcytometri dot plots viser at alle tre PnP cellelinjer uttrykker IgH og IgK følgende sortering i a . ( c, d ) I likhet med a og b er strømningscytometripunktplottene for PnP-HEL23.2-celler, som ble generert på samme måte som PnP-HEL23 med unntak av at sorteringssteget Cas9 + (2A-BFP) ble utelatt . ( e ) Som i figur 2f viser plot dannet fra sandwich ELISA at alle versjoner av PnP-antistoff produserende celler utskiller IgG i supernatanten. For hver prøve ble tre tekniske replikater analysert og en logaritmisk kurve med fire parametere ble tilpasset dataene ved ikke-lineær regresjon. Data presenteres som gjennomsnittet og feillinjene indikerer standardavvik. ( f ) Som på fig. 2h ble RT-PCR utført på mRNA verifisert korrekt innføring og spleising av sAb-donorer (WT og PnP-mRuby-celler mottatt en blanding av fremre VL-spesifikke primere). Gjennom denne figuren tilsvarer PnP-HyHEL10 klon U, PnP-2G4-EBV tilsvarer klon AA, og PnP-4G7-EBV tilsvarer klone AB, PnP-HEL23.2 tilsvarer klon AC (for ytterligere detaljer se Supplementær tabell 1).

Full størrelse bilde

For ytterligere å demonstrere enkelheten og hurtigheten til å generere nye PnP-antistoffkloner, vi elektroporerte PnP-mRuby-celler med pX458.2 (gRNA-J) og HEL23-donor, gjentatt opprettelsen av PnP-HEL23 (figur 2) med unntak av unnlate den første Cas9 (2A-BFP) sorteringen ved ~ 48 timer etter elektroporasjon. Til tross for en høyere bakgrunn av mRuby + -celler, var en klar IgH + -populasjon synlig (figur 4c), med en trend som ligner på prøver utsatt for Cas9 + -sortering (figur 4a). Etter sortering for IgH + -uttrykk og ekspansjon var PnP-HEL23.2-celler jevnt dobbelt positive for IgH og IgK-ekspresjon (figur 4d). Sandwich ELISAer for alle ytterligere cellelinjer bekreftet at det var tydelig sekresjon av IgG i supernatanten, selv om det igjen var lavere i forhold til foreldre WEN1.3-celler (figur 4e). PCR på mRNA førte til et dominerende produkt som indikerte korrekt integrasjon av alle sAb-donorkonstruksjoner; I tilfelle av PnP-HyHEL10 og PnP-2G4 var imidlertid ytterligere bånd svakt til stede, muligens indikerer alternative innføringer av sAb (figur 4f, se avsnittet "Diskusjon").

Diskusjon

Vi har etablert en plattform for immunogenomisk omprogrammering av hybridomceller, som fører til rask generering av cellelinjer som begge overflater uttrykker og utskiller fulllengte antistoffer. I utgangspunktet brukte vi Cas9-assistert HDR til å erstatte VH-eksonen til IgH-locuset med mRuby-genet, og opprettet en fenotypisk merket cellelinje for å starte nedstrømsprogrammeringsprogrammer. Deretter kunne vi bytte mRuby med sAb-donorkassetter, også via Cas9-assistert HDR. Selv om det er godt etablert at genutveksling kan oppnås gjennom mekanismer for homolog rekombination, er dette ofte avhengig av bruk av mektige genkonstruksjonsteknologier for å samle svært lange homologarmarmer, som kan variere fra 3 til 5 kb og i noen tilfeller opptil 20 kb (ref. 28). En mer vanlig måte å utføre genutveksling på er via recombinase-mediert kassettutveksling (RMCE) ved bruk av systemer som Cre-loxP eller Flp-FRT 29 . Imidlertid krever RMCE a priori- tilstedeværelsen av flankerende stedspesifikke rekombinase-anerkjennelsessteder ((for eksempel flankert av loxP (floxed)) 30, som måtte settes inn i genomet på forhånd (via homolog rekombination). I første omgang forsøkte å bruke RMCE, ved hjelp av en floxed-mRuby-donor (tilleggsbilde 3). Etter elektroporering av PnP-floxed-mRuby-celler med Cre recombinase-plasmid og flaskede donorer kunne vi imidlertid ikke observere noen klare tegn på RMCE. Kontrast, når du utfører mRuby-utveksling via Cas9-assistert HDR, var vi lett i stand til å identifisere celler som har gjennomgått genutveksling (figur 2 og 4). Enkelheten av denne metoden er tydelig av det faktum at det bare krevde et enkelt elektroporasjonstrinn ved å bruke en donor-kassett med korte homologearmer (<1 kb). Mens den nåværende versjonen av vår PnP-plattform bruker mus CH- regioner som svarer til IgG2c, kan Cas9-assistert HDR i fremtiden brukes til å erstatte CH- exoner med andre Ig-subtyper, inkludert ose fra andre arter som menneske 15, kanin, ape, som ville ha verdi for å produsere mAb-terapeutiske midler og reagenser.

Generell generering av mAb-produserende pattedyrcellelinjer resulterer vanligvis ikke i antistoffoverflatevisning som krever tilstedeværelse av et selekterbart reportergen for å indikere positiv transgeninnføring. For å eliminere behovet for utvelgelse basert på sekundære reportere, ville antistoffoverflateekspressjon og -sekresjon være nødvendig i de samme cellene, gjennom alternativ spleising (eller en induktiv omkoblingsbasert tilnærming) 31 . Et slikt system er blitt beskrevet i pattedyrceller gjennom transient transfeksjon av plasmider som bærer alternativ IgH-spleising 32 . En fordel ved vår PnP-plattform er at ved bruk av endogene hybridom-C-regioner, er vi i stand til å utnytte innfødt alternativ spleising for å få overflateekspresjon og utskillelse av mAbs fra samme hybridomcelle. Som en følge av dette er det lett å oppdage positiv målrettet innsetting av sAb-donorer i PnP-mRuby-celler ved ekspresjon og flekking av overflateantikropp (fig. 2 og 4). Videre forventes ikke off-target-innskudd å resultere i full lengde antistoff-transkripsjoner siden spleising er nødvendig mellom sAb VH og CHl-regionen i genomet. Dette lindrer bekymringen for at PnP-celler som er valgt for antistoffuttrykk, var et resultat av tilfeldig integrering i off-target-pauser generert av Cas9 (ref. 33). Imidlertid observert vi i noen tilfeller en mindre forekomst av større konstruksjoner integrert i IgH-lokalet i antistoffreprogrammerte PnP-celler (figur 4f). Det er mulig at disse er en konsekvens av at dupliserte sAb-donorer blir satt inn i DSB-stedet via NHEJ 34 . Den bredere anvendeligheten av vårt PnP-system ble etablert ved å generere flere cellelinjer som produserte flere forskjellige antistoffer. I tillegg til fordel for hastighet og kostnadseffektivitet kunne vi optimalisere arbeidsflyten der bare et enkelt transfeksjons- og screeningstrinn var nødvendig for å oppnå en homogen populasjon av antistoffproducerende celler (figur 4c, d).

Selv om vår PnP-plattform muliggjør rask og enkel konvertering av hybridomspesifikitet, er det ikke uten en potensiell ulempe; vi observerte et redusert nivå av antistoffsekresjon i alle omprogrammerte hybridomceller (fig. 2f og 4e). Det er godt dokumentert at presis optimalisering av differensielle IgK- og IgH-ekspressionsnivåer fører til mer produktive rekombinante antistoffproducerende stabile cellelinjer 35, 36 . I tillegg er det blitt rapportert at full lengde antistoff ekspresjon ved bruk av et virus 2A peptid kan resultere i feil behandlede polypeptider, som demper samling og ekspresjon av korrekt foldede full lengde antistoffer 37 . I et forsøk på å opprettholde enkelhet ved bruk av en enkelt HDR-hendelse, utnytter PnP-systemet fordelene med den innfødte tunge kjedepromotoren for ekspresjon av både IgK og IgH som et enkelt transkript forbundet med 2A-peptidet. En mulig forklaring på den observerte reduksjon i sekresjon er således at koblede transkripsjoner uttrykt fra en enkelt promotor kan resultere i suboptimale ekspresjonsforhold som er nødvendige for robust sekresjon. Imidlertid er det interessant å merke seg at selv om antistoffsekresjonen er redusert, observert vi lignende nivåer av overflateantistoffuttrykk i både WT og PnP-celler (figur 1f og 2e). Selv om redusert antistoffutskillelse er en nåværende begrensning av vårt PnP-system, kan det i fremtiden bli tatt flere strategier for å overvinne dette, som for eksempel bruk av multiplex-HDR for samtidig mål og utveksling av V L- og V H- regioner, eller inkludering av en andre promotor integrert i sAb-donorkonstruksjonen. Videre blir det mulig å integrere slike metoder i vårt PnP-system, med en rekke avanserte genome-redigeringsteknologier utviklet for transkripsjonsregulering 38, 39 . Vi ser at ved hjelp av omfattende PnP-celler, kan vi til slutt kunne oppnå mAb-produksjonsnivåer som er sammenlignbare med de som genereres av industrielle cellelinjer.

Selv i nærvær av en homologi-donorkonstruksjon, forblir NHEJ den foretrukne reparasjonsmekanismen etter DSB-generasjon 40, da vi faktisk så utslag av mRuby-ekspresjon i en betydelig del av celler etter transfeksjon med CRISPR-Cas9 (figur 2d). Det har imidlertid vært gjort en ny innsats for å foreta bias reparasjon mot HDR gjennom bruk av både kjemisk og genetisk genregulering 41, 42, 43 . I tillegg har det blitt vist at konstitutiv ekspresjon av Cas9 i celler også er i stand til å forbedre HDR-effektivitet 44, 45 . Det er også potensial for å optimalisere gRNA-målsteder gjennom syntetiske protospacere designet for å maksimere on-target spaltningsaktivitet 46 . En kombinasjon av disse strategiene kan brukes på vår PnP-plattform, og dermed kan det resultere i større HDR-effektivitet, noe som vil forenkle utvalget ytterligere. Høyere HDR-effektivitet øker muligheten for å innlemme antistoff- eller proteinbiblioteker i PnP-celler, som kan screenes ved overflatevisning og dermed muliggjøre applikasjoner i rettet evolusjon og proteinteknikk 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 .

Et stort konsortium av biomedisinske forskere har nylig rapportert at en betydelig investering av forskningskostnader og ressurser går tapt på grunn av bruk av ikke-standardiserte antistoffreagenser (for eksempel polyklonale antistoffer) 54 . De foreslo at et mye høyere nivå av reproduserbarhet og konsistens ville oppnås ved standardisering av antistoffreagenser. Dette krever først større tilgang til antistoffvariabel region-sekvenser og deres tilhørende spesifisiteter, noe som blir mulig på grunn av de raske fremskrittene i høy gjennomstrømningssekvensering av antistoffrepertoarer 55, 56, 57 . I tillegg er det også et behov for å oversette de variable region-sekvensene av antistoffreagenser til rekombinante mAbs. Dette problemet fremhever behovet for systemer som muliggjør rask produksjon av mAb-produserende cellelinjer, som kan tilpasses behovene til et typisk forskningslaboratorium. Ved å oppnå målrettet integrasjon, representerer vår PnP-plattform et sentralt skritt fremover for å gjøre prosessen mer tid og kostnadseffektiv, og dermed mulig for flere forskere. I sammenheng med mAb-terapeutikk, utheste 2014-utbruddet av Ebola-virusinfeksjon og produksjonsmangel på den lovende medisinekandidaten ZMapp, en cocktail på tre mAbs, det kritiske behovet for teknologi for raskere generering av stabile cellelinjer 58, 59, 60 . Selv om det er behov for betydelig innsats for å forbedre antistoffuttrykknivåer, tror vi at vår PnP-plattform til slutt kan spille en verdifull rolle for terapeutisk mAb-produksjon også.

metoder

Hybridomcellekulturbetingelser

WT-hybridomcellelinjen (WEN1.3) ble oppnådd som en gave fra professor Annette Oxenius (ETH Zürich). Alle hybridomcellelinjer ble dyrket i høyglukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), Thermo Fisher Scientific (Thermo), 11960-044) tilsatt 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), Thermo, 10082-147), 100 U ml -1 penicillin / streptomycin (Thermo, 15140-122), 2 mM glutamin (Sigma-Aldrich, G7513), 10 mM HEPES buffer (Thermo, 15630-056) og 50 μM 2-merkaptoetanol (Sigma-Aldrich, M3148). Alle hybridomceller ble opprettholdt i inkubatorer ved en temperatur på 37 ° C og 5% CO2. Hybridomer ble vanligvis opprettholdt i 10 ml kultur i T-25 kolber (Thermo, NC-156367) og passert hvert 48/72 timer. WT-hybridom (WEN1.3) og PnP-mRuby-cellelinjen (klon 1E9.C3) ble bekreftet å være negative for Mycoplasma- forurensning (Universal Mycoplasma Detection Kit, ATCC, 30-1012K).

Kloning og montering av CRISPR-Cas9-målkonstruksjoner

Grunnlaget for CRISPR-Cas9-eksperimenter var basert på plasmidet pSpCas9 (BB) -2A-GFP (pX458), oppnådd som en gave fra Feng Zhang (Addgene-plasmid # 48138) 23 . Alle gRNAer ble erholdt fra Integrated DNA Technologies (IDT) som enkeltstrengede 5'-fosforylerte oligonukleotider renset ved standard avsalting. For kloning av gRNA ble begge versjoner av pX458 fordøyd med BbsI (New England BioLabs (NEB), R0539S), gRNA-oligonukleotider ble ligert i plasmider med DNA T4-ligase (NEB, M0202S). Alle HDR-donorkonstruksjoner ble samlet ved Gibson-kloning ved bruk av Gibson Assembly Master Mix (NEB, E2611S) 61 . Ved behov ble fragmenter for kloning av Gibson-samlingen forsterket med KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA Biosystems (KAPA), KK2602). Genet for mRuby (mRuby2-variant) ble avledet fra plasmid pcDNA3-mRuby2, en gave fra Michael Lin (Addgene plasmid # 40260) 62 . HDR-donorene (mRuby og antistoffkonstruksjonene) ble klonet i pUC57 (Kan) -HDR-plasmidet, oppnådd fra Genewiz. Vektoren ble utformet med homologarmarmer i henhold til den annoterte mus-genomiske sekvensen (GRCm38). 2A-antistoffkonstruksjonene ble oppnådd som syntetiske genfragmenter (gBlocks, IDT). MRuby HDR-donoren ble linearisert ved restriktionsfordøyelse med enzymet NruI (NEB, R0192S). Antistoff HDR-donorvektorer ble linearisert ved PCR med KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, KK2602). En alternativ versjon av pX458 ble generert gjennom Gibson kloning ved å erstatte GFP (eGFP variant) med BPF (TagBFP variant; pX458.2 eller pSpCas9 (BB) -2A-BFP). Alle plasmid PX458 og HDR-donorer ble etanol utfelt som et sluttrensingstrinn.

Hybridomtransfeksjon med CRISPR-Cas9-konstukter

Hybridomceller ble elektroporert med 4D-Nucleofector System (Lonza) ved bruk av SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L (Lonza, V4XC-2024) med programmet CQ-104. Cellene ble fremstilt som følger: 10 6 celler ble isolert og sentrifugert ved 90 g i 5 minutter, vasket med 1 ml Opti-MEM I redusert serummedium (Thermo, 31985-062) og sentrifugert igjen med de samme parametere. Cellene ble til slutt resuspendert i 100 ul totalvolum av nukleofeksjonsblanding, inneholdende vektoren / vektorene fortynnet i SF-buffer (per kit-produsentens retningslinjer). For utveksling av VH-locus ble 5 ug pX458 (eller pX458-BFP) med gRNA-E (målrettet VH) eller gRNA-J (målretting mRuby) og 5 ug av de sirkulære eller lineære HDR-donorkonstruksjonene nukleofektert i celler. For VL-deletion ble 5 μg hver av pX458 med gRNA-F og gRNA-H samtransfektert inn i celler. Etter transfeksjon ble dyrene vanligvis kultivert i 1 ml vekstmedium i brønner med 24 brønner (Thermo, NC-142475). Når en signifikant celleekspansjon ble observert, ble cellene supplert 24 timer senere med 0, 5-1, 0 ml friske vekstmedier. Etter sortering, typisk 48 timer etter transfeksjon, ble cellene gjenvunnet i brønner med 24 brønner og ble gradvis flyttet inn i 6-brønnsplater (Thermo, NC-140675) og T-25 flasker, etter utvidelse. Etter å ha erstattet VH med mRuby, ble cellene singelceller sortert i U-bunnplater med 96 brønner (Sigma-Aldrich, M3562) i et gjenvinningsvolum på 100 ul. Klonene ble til slutt utvidet i brønner med 24 brønner, seks brønnplater og T-25 flasker. Den samme enkeltcellesorteringsprosedyr ble vedtatt for isolering av kloner etter Vl-knockout.

Genomisk og transkripsjonsanalyse av CRISPR-Cas9-målretting

Genomisk DNA av hybridomcellelinjer ble gjenvunnet fra typisk 10 6 celler, som ble vasket med PBS (Thermo, 10010-015) ved sentrifugering (250 g, 5 min) og resuspendert i QuickExtract DNA-ekstraksjonsløsning (Epicenter, QE09050). Cellene ble deretter inkubert ved 68 ° C i 15 minutter og 95 ° C i 8 minutter. For transkripsjonsanalyse ble totalt RNA isolert fra 10 6 til 5 x 106 celler. Cellene ble lysert med TRIzol-reagens (Thermo, 15596-026) og totalt RNA ble ekstrahert med Direct-zol RNA MiniPrep-settet (Zymo Research, R2052). Maxima revers transkriptase (Thermo, EP0742) ble brukt for komplementær DNA (cDNA) syntese fra totalt RNA. Både genomisk DNA og cDNA ble brukt som maler for nedstrøms PCR-reaksjoner.

GRNAene rettet mot WT IgH og IgK loci og mRuby ble først testet for deres aktivitet ved induksjon av NHEJ. Det målrettede fragment ble amplifisert ved PCR med KAPA2G Fast ReadyMix (KAPA, KK5121) og PCR-produktet spaltet med Surveyor-nukleasen for påvisning av feilmatchinger (Surveyor Mutation Detection Kit, IDT, 706020). For HDR-evaluering ble PCR utført på genomisk og cDNA ved bruk av primere som ble bundet i og utenfor homologarmarmer (se tilleggstabell 4), etterfulgt av fragmentstørrelsesanalyse på DNA agarosegeler. Utvalgte PCR-produkter ble utsatt for Sanger-sekvensering, direkte etter PCR eller etter kloning i bakterielle plasmider. For evaluering av HDR-utveksling i VH-lokalet ble følgende syklusbetingelser anvendt på genomisk DNA: initial denaturering 3 minutter ved 95 ° C; 35 sykluser med denaturering ved 95 ° C (15 s), annealing ved 58 ° C (15 s), forlengelse ved 72 ° C i 1, 5 min (PnP-mRuby cellelinjeopprettelse) eller 2, 6 min (PnP-antistoffcellelinjeopprettelse) ; slutt forlengelse ved 72 ° C i 1, 5 min (PnP-mRuby cellelinjeopprettelse) eller 2, 6 min (PnP-antistoffcellelinjeopprettelse). For evaluering av VL-deletion ble følgende syklusbetingelser brukt på genomisk DNA: initial denaturering 3 minutter ved 95 ° C; 35 sykluser med denaturering ved 95 ° C (15 s), annealing ved 61 ° C (15 s), forlengelse ved 72 ° C i 20 s; endelig forlengelse ved 72 ° C i 1, 25 min. For påvisning av korrekt spleisert antistoff-transkripsjoner ble cDNA amplifisert med Taq DNA-polymerase med ThermoPol Buffer (NEB, M0267S). Følgende syklusbetingelser ble anvendt: initial denaturering 3 minutter ved 92 ° C; 28 sykluser med denaturering ved 92 ° C (1 min), annealing ved 60 ° C (1 min), forlengelse ved 72 ° C i 1, 5 min; endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 minutter. Primmerene som brukes for amplifisering og deres sekvenser er oppført i tilleggstabell 4. Ucropped versjoner av genomisk og RT-PCR vist i figurene 1, 2 og 4 er rapportert i tilleggsskjema 9. Til referanse er de anvendte DNA-størrelsesmarkører som er brukt GeneRuler 1 kb DNA-stige (Thermo, SM0314) og GeneRuler 100 bp DNA-stige (Thermo, SM0243).

Flowcytometrianalyse og sortering av hybridomer

Flowcytometri-basert analyse og celleisolasjon ble utført ved bruk av henholdsvis BD LSR Fortessa og BD FACS Aria III (BD Biosciences). Ved 24 timer etter transfeksjon ble ~ 100 ul celler oppsamlet, sentrifugert ved 250 g i 5 minutter, resuspendert i PBS og analysert for ekspresjon av Cas9 (via 2A-GFP / -BFP). Åttiåtte timer etter transfeksjon ble alle transfekterte celler samlet og resuspendert i sorteringsbuffer (SB (PBS tilsatt 2 mM EDTA og 0, 1% BSA)). Når det ble påkrevet merking, ble cellene vasket med PBS, inkubert med merkingsantistoffet eller antigenet i 30 minutter på is, beskyttet mot lys, vasket igjen med PBS og analysert eller sortert. Mærkningsreagensene og arbeidskonsentrasjonene er beskrevet i tilleggstabell 3. For celle tall forskjellig fra 10 6 ble antistoff / antigenmengden og inkubasjonsvolumet justert proporsjonalt.

Måling av antistoffsekresjon med ELISA

Sandwich ELISAer ble brukt til å måle sekresjonen av IgG fra hybridomcellelinjer. Plattene ble belagt med polyklonal anti-lettkjæring-fangst (geit-anti-mus, Jackson ImmunoResearch, 115-005-174) konsentrert ved 3, 7-4 μg ml -1 (1: 325 fortynning fra lager) i PBS (Thermo, 10010- 015). Platene ble deretter blokkert med PBS tilsatt 2% m / v-melk (AppliChem, A0830) og 0, 05% V / V Tween-20 (AppliChem, A1389, PBSMT). Etter blokkering gjennomgikk platene tre vaske-trinn med PBS tilsatt Tween-20 0, 05% V / V (PBST). Supernatanter fra cellekultur (10 6 celler pr. Prøve, volum normalisert til minst konsentrerte prøver) ble deretter serielt fortynnet (ved 1: 3 forhold) i PBS tilsatt 2% m / v melk (PBSM), utgående fra den ikke-fortynnede supernatant som den høyeste konsentrasjonen. Supernatanter ble inkubert i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C, etterfulgt av tre vaskestrinn med PBS tilsatt Tween-20 0, 05% V / V (PBST). HRP-konjugert polyklonalt anti-mus Fc-region (geit-anti-mus, Sigma-Aldrich, A2554) ble anvendt som sekundært antistoff, konsentrert ved 1, 7 μg ml -1 (1: 5000 fortynning fra lager) i PBSM etterfulgt av tre vaskestrinn med PBST. ELISA-deteksjon ble utført ved bruk av en 1-trinns Ultra TMB-ELISA-substratløsning (Thermo, 34028) som HRP-substratet, reaksjonen ble avsluttet med H2S04 (1 M). Absorbans ved 450 nm ble lest med Infinite 200 PRO NanoQuant (Tecan).

For antigen-spesifisitetsmålinger ble platene belagt med renset høne-egglysozym (Sigma-Aldrich, 62971-10G-F) konsentrert ved 4 μg ml -1 i PBS. Plater ble deretter blokkert med PBS tilsatt 2% m / v melk (AppliChem, A0830) og 0, 05% V / V Tween-20 (AppliChem, A1389) (PBSMT). Etter blokkering gjennomgikk platene tre vaske-trinn med PBS tilsatt Tween-20 0, 05% V / V (PBST). Supernatanter fra cellekultur (10 6 celler pr. Prøve, volum normalisert til minst konsentrerte prøver) ble deretter serielt fortynnet (ved 1: 5 forhold) i PBS tilsatt 2% m / v-melk (PBSM), utgående fra den ikke-fortynnede supernatanten som den høyeste konsentrasjonen. En HRP-konjugert monoklonal anti-mus kappa lettkjede (rotte anti-mus, Abcam, AB99617) konsentrert ved 0, 7 ug ml -1 (1: 1, 500 fortynning fra lager). ELISA-deteksjon ble utført ved bruk av en 1-trinns Ultra TMB-ELISA-substratløsning (Thermo, 34028) som HRP-substratet, reaksjonen ble avsluttet med H2S04 (1 M). Absorbans ved 450 nm ble lest med Infinite 200 PRO NanoQuant (Tecan). ELISA-data ble analysert med programvare GraphPad Prism.

Datatilgjengelighet

Alle cellelinjer, materialer og relevante data generert i denne studien er tilgjengelig på forespørsel. Relevante genomiske DNA- og / eller cDNA-sekvenser fra WT hybridoma, PnP-mRuby, PnP-HEL23 cellelinjer og HDR-donorvektorer er tilgjengelige på GenBank (//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) med følgende tiltredelse tall: KX398103 (Wen1.3 hybridom IgH genomisk locus), KX431572 (Wen1.3 hybridom IgK genomisk locus), KX377895 (PnP-mRuby redigert konstruert IgH genomisk locus), KX431573 (PnP-HEL23 redigert VH lokus fra genom), KX431574 PnP-HEL23 spleiset syntetisk antistoff (sAb)), KX431576 (pUC57 (Kan) -mRuby2-HDR homolog donor plasmid), KX431575 (pUC57 (Kan) -HEL23-HDR homolog donor plasmid).

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

    Supplerende figurer 1-9 og tilleggstabeller 1-4

  2. 2.

    Peer review-fil

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens