Anonim

Temaer

  • apoptose
  • åreforkalkning
  • Monocytter og makrofager
  • Blodplater plater~~POS=HEADCOMP

  • En Erratum til denne artikkelen ble publisert 24. november 2011

Denne artikkelen har blitt oppdatert

Abstrakt

Blodplanter kaste mikropartikler ikke bare ved aktivering, men også ved aldring ved hjelp av en apoptose-lignende prosess (apoptoseinducerte blodplatermikropartikler, PM ap ). Selv om de aktiveringsinducerte mikropartikler har blitt mye studert, er det ikke mye kjent om (pato) fysiologiske konsekvenser av PM ap- dannelse. Flowcytometri og skanningelektronmikroskopi viste at PM ap viser aktiverte integriner og interagerer for å danne mikropartikkelaggregater. PM ap var kjemotaktisk for monocytiske celler, bundet til disse cellene, en videre stimulert celleadhesjon og spredning på en fibronektinoverflate. Etter langvarig inkubering promoterte PM ap celledifferensiering, men hemmet proliferasjon. Monocytmembranreseptoranalyse avdekket økte ekspressionsnivåer av CD11b (integrin αMβ2 ), CD14 og CD31 (blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl-1) og chemokinreceptorene CCR5 og CXCR4, men ikke av CCR2. Dette indikerte at PM ap polariserte cellene til residente M2 monocytter. Celler behandlet med PM ap aktivt konsumert oksidert lipoprotein med lav densitet (oxLDL) og frigjorte matriksmetalloproteinaser og hydrogenperoksid. Ytterligere bekreftelse for differensieringen mot bosatt fagfagocytter kom fra funnet at PM ap stimulerte uttrykket av (oks) LDL-reseptorene, CD36 og CD68, og produksjonen av proinflammatoriske og immunmodulerende cytokiner med monocytter. Til sammen har samspillet mellom PM ap og monocytiske celler et immunmodulerende potensial. De apoptotiske mikropartiklene polariserer cellene til et hjemmehørende M2-undersett, og induserer differensiering til bosatt profesjonelle fagocytter.

Hoved

Tilstedeværelsen av mikropartikler i blodplaterrikt plasma har først blitt beskrevet i slutten av 60-årene, hvor disse ble betegnet som blodplate-støv. 1 Siden den tiden har rollen av blodplate-avledede mikropartikler i (pato) fysiologi av trombose og hemostase vært godt etablert. Sirkulerende blodplatermikropartikler i normal perifer blodstøtte med lav trombingenerering. 2 Etter operasjon og under trombotiske tilstander, kan nivåene av mikropartikler i plasma øke betydelig, 3, 4 og dette har vært assosiert med patologiene av kardiovaskulære sykdommer, 5 betennelse og aterosklerose. Dannelsen av disse mikropartiklene anses å være en konsekvens av blodplateaktivering med potente agonister, noe som faktisk gir opphav til massiv avstøpning av "aktiveringsinducerte" mikropartikler med et sterkt prokoaguleringspotensial in vitro . 6

Blodplater sirkulerer i blod i 9-10 dager, og fjernes deretter i milten eller leveren etter en apoptotisk-lignende prosess. 7, 8 Denne aldersinducerte blodplateapoptose fører også til avstøpning av mikropartikler, men tydeligvis er denne prosessen ikke ledsaget av tegn på blodplateaktivering. 9, 10 Følgelig er det en kontinuerlig dannelse av apoptoseinducerte blodplate-mikropartikler (PM ap ) i blod fra aldring, tilsynelatende hvilende blodplater. Fagocytter, inkludert monocytter, dendritiske celler og makrofager, er ansvarlige for klaring av apoptotiske blodplater og også PM ap fra sirkulasjonen. 11 Betingelser som stimulerer trombocytapoptose eller undertrykkelse av fagocytose vil dermed øke plasmanivåene av PM ap, noe som kan forverre betennelsesbundne forstyrrelser som aterosklerose.

Mye oppmerksomhet er blitt betalt til mikropartikler som genereres fra aktiverte blodplater. For eksempel har deres høye prokoaguleringspotensial blitt karakterisert, 12 deres proteom med mange bioaktive forbindelser - inkludert CCL5, CXCL4 og CXCL7 - har blitt unraveled 13, 14 og de har nylig blitt vist å øke det vasoregenerative potensialet for angiogene tidlige utvoksningsceller. 15 I stedet er det svært liten kunnskap om biologiske effekter av de "spontant" dannede apoptoseinducerte mikropartikler, PM ap . Her antydet vi at PM ap har en immunmodulerende rolle ved å interagere med leukocytter, særlig monocytter. Vi har som mål å karakterisere denne rollen ved å bestemme kort- og langtidseffekter av interaksjonene av PM ap med monocytiske celler og primære monocytter.

resultater

Interaksjoner av monocytiske celler med PM ap

Mikropartikkel-holdig blodplatefri plasma ble isolert fra lagrede blodplasma-plasmakonsentrater (5 dagers lagring) hvor skur apoptotiske mikropartikler akkumulerer tidsavhengig uten blodplateaktivering 10 (Figur 1a, venstre panel), som visualisert ved strømningscytometri ved bruk av CD61 ( glykoprotein (GP) IIIa) ekspresjon som en blodplate-spesifikk markør (Figur 1a, høyre panel). Plasmaet ble mikroskopisk kontrollert for nærvær av PM ap og fravær av intakte blodplater. Ved anvendelse av en kombinasjon av mikroporefiltrering (0, 8 μm ) og ultracentrifugering for å fjerne intakte blodplater ble PM ap isolert og kjennetegnet ved strømningscytometri, med ferske isolerte blodplater som referanse. PM-fraksjonen inneholdt for det meste partikler med <1 μm i størrelse, men også merkbart antall partikler med større størrelse (figur 1b). Disse større partiklene kan aggregeres PM ap, idet skanningelektronmikroskopi avslørte tilstedeværelsen av enkle såvel som aggregerte mikropartikler (figur 1c). Flowcytometri karakterisering viste videre at CD61 ekspresjon var lavere i PM ap enn i hvilende blodplater (kompatibel med størrelsesforskjellen), og at den aktiverte konformasjonen av GPIIb / IIIa (detektert med PAC1 monoklonalt antistoff (mAb)) var høyere i PM ap ( Figur 1d og e). I PM ap ble uttrykket av markører med sterk aktivering, for eksempel CD62P (P-selektin) og fosfatidylserin (vedlegg A5-binding), økt i sammenligning med hvile blodplater. Sammen angav dette at PM ap antar en aktiveringstilstand med prokoagulerende fosfolipider og aktiverte integriner, og forklarer dermed deres evne til å danne aggregater.

Karakterisering av apoptoseinducerte blodplatermikropartikler. ( a ) Spontan generasjon av PM ap i blodplater lagret i RPMI + 5% FBS ved 37 ° C i 1-7 dager (venstre panel) og flytcytometrisk visualisering av blodplater og PM ap (høyre panel, markerte områder, AG: aggregater) og ( b ) PM ap isolert fra 5-dagers blodplate-konsentrater. Staining var med FITC-merket anti-CD61mAb, og 1 μm og 6 μm perler ble tilsatt som størrelsesmarkører (i rammer). ( c ) Elektronmikroskopi av blodplater og PM ap, danner små aggregater (piler og høyre panel). ( d ) Flowcytometri deteksjon for hvile blodplater (plts) og PM ap av ekspressionsnivåer av GPIIb / IIIa (FITC anti-CD61mAb), aktivert GPIIb / IIIa (FITC PAC1mAb), P-selektin (FITC-anti-CD62PmAb) og fosfatidylserin (APC-annexin A5). Mean ± SEM ( n = 4-6). * P <0, 05 mot blodplater. ( e ) Representative histogrammer av flowcytometrianalysen, fylt histogram: (isotype) kontroll, punktert linje: blodplater, fast linje: PM ap

Full størrelse bilde

Vi undersøkte deretter muligheten til PM ap å binde til THP-1-celler, en etablert monocytisk cellelinje. Elektronmikroskopi oppdaget flere PM ap på overflaten av THP-1-celler coinkubert med mikropartiklene (figur 2a). Flowcytometri ved bruk av anti-CD61mAb indikerte at PM ap- bindingen til celler økte mellom 30 minutter og 70 minutter (figur 2b og c). Ved senere tidspunkt ble CD61-bindingssteder på celleoverflaten redusert igjen. Dette foreslo at PM ap ble internalisert av endocytose, som kunne bekreftes ved konfokal mikroskopi avslørende PM ap lokalisert på overflaten og i cytoplasma av THP-1-cellene (Figur 2d og Supplemental movie). Binding var helt fraværende etter varmebehandling av PM ap (56 ° C i 30 minutter, data ikke vist), hvilket indikerer nødvendigheten av aktive adhesjonsmolekyler på PM ap- overflaten for interaksjon med monocytiske celler. For å avgjøre om PM ap inneholder biologisk aktivitet mot blodceller, brukte vi en Transwell migreringsanalyse som oppdaget kjemotaktiske effekter på THP-1-celler. Påfallende, PM ap fremkalte robust celle-migrasjon, som var sammenlignbar med referansekemokinet, CCL2 (figur 2e), hvilket indikerer et sterkt kjemotaktisk potensial for mikropartiklene. For å undersøke de potensielle mediatorene som ble avledet fra PM ap, brukte vi blokkering av antistoffer mot CCL5 og CXCL7, to blodplateavledede kjemokiner som har vist seg å mediere rekonstruksjon av mononukleær celle (MC). 16 Kemotaksen av THP-1-celler mot PM ap kunne effektivt blokkeres med antistoffer mot CCL5, mens anti-CXCL7 eller isotype antistoffer ikke viste noen effekt (figur 2e). Dette antyder at CCL5 er en viktig faktor som styrer monocytmigrasjon i retning av PM ap .

Påvirkning og interaksjon av PM ap med monocytter. ( a ) Elektronmikroskopi av flere PM ap bundet til THP-1 celler etter 30 min coincubation. ( b ) Flowcytometri deteksjon av PM ap eller hvilende blodplater (plts) bindende til THP-1-celler (FI). Celler (2 x 106 celler / ml) ble inkubert med vehikelkontroll (ctrl), PM ap (2 x 10 8 celler / ml) eller blodplater (2 x 10 8 celler / ml) i 30-180 min. Koagulerer med THP-1-celler ble farget med FITC anti-CD61mAb. Mean ± SEM ( n = 4-6). * P <0, 05 mot kontroll, ° P <0, 05 mot 70 min tidspunkt. ( c ) Representative histogrammer av fluorescensendringer i THP-1-celler på grunn av PM ap- binding. Merk sekundær reduksjon etter 180 min inkubasjon, indikativ for internalisering. ( d ) Konfokalmikroskopi av THP-1-celler coinkubert med PM ap i 4 timer ved RT. Skalbjelke: 10 μm, grønn fluorescens: CD61, rød fluorescens: CD45. ( e ) I Transwell-kamrene ble antallet THP-1-celler som ble migrert i løpet av 24 timer mot PM ap (10 8 celler / ml) målt i de nedre kamre. CCL2 (50 ng / μl) ble anvendt som en positiv kontroll. I tillegg ble PM ap preinkubert med anti-CCL5, anti-CXCL7 og isotype IgG1mAb (10 μg / ml, 40 min ved RT), og celler ble igjen for transmigrasjon. Mean ± SEM ( n = 3). * P <0, 05 versus kontroll, ° P <0, 05 mot PM ap og anti-CCL5mAb

Full størrelse bilde

PM ap- indusert adhesjon av monocytiske celler under statiske og strømningsbetingelser

Eksperimenter ble utført for å bestemme de funksjonelle konsekvensene av monocytiske celleinteraksjoner med PM ap . Preinkubasjon av THP-1-celler med PM ap (44 timer) forårsaket en markert økning i stabil adhesjon til fibronektinbelagte brønner under statiske forhold. Denne effekten var like effektiv som inkuberingen med phorbolmyristatacetat (PMA, figur 3a). Det hadde en tendens til å øke med høyere teller av PM ap, mens supernatanter fra PM ap preparater var inaktive. Også forinkubasjon med hvilende blodplater, tilsatt ved lignende teller, påvirket ikke adhesjonen. Som blodplater spontant kaster PM ap, kan genereringen av PM ap i løpet av saminkubasjonsforsøkene med hvilende blodplater påvirke våre funn (Figur 1a). For å utelukke potensielle effekter fra denne spontant genererte PM ap, bestemte vi først mengden PM ap dannet etter 7 dager i forhold til 10/1 forholdet mellom PM ap som vi vanligvis brukte i våre eksperimenter (figur 3b). I en etterfølgende adhesjonsanalyse sammenlignet vi de funksjonelle virkningene av denne mengden PM ap med 10/1 forholdet PM ap . Som forventet ble det ikke observert noen effekter av denne mindre mengden PM ap (Figur 3c).

Adhesjon av monocytiske celler indusert av PM ap . ( a ) Statisk adhesjon til en fibronektinoverflate etter 44 h inkubasjon av THP-1-celler (1, 5 x 105 celler / ml) med vehikelkontroll (ctrl), PM ap (forhold per celle, 10/1 eller 30/1) hvilende blodplater (plts; forhold per celle, 10/1 eller 30/1) eller supernatant fra sentrifugert PM ap (sup). Som positiv kontroll ble THP-1-celler inkubert med PMA (10 ng / ml). Legg merke til økt adhesjon med PM ap i forhold til blodplater. ( b ) Mengden PM ap spontant generert under inkubering med blodplater (svart bar) sammenlignet med det eksperimentelt anvendte 10/1-forhold av PM ap . ( c ) Statisk adhesjon til en fibronektinoverflate etter 44 h inkubasjon av THP-1-celler (1, 5 x 10 5 / ml) med vehikel (ctrl) og PM ap (forhold pr. celle, 0, 5/1 eller 10/1). ( d ) Adhesjon av primære monocytter under lavskjærstrømning over et monolag av sammenflytende endotelceller. Monocytter ble forinkubert i 44 timer med vehikelkontroll (ctrl), PM ap (forhold, 10/1) eller hvilende blodplater (forhold, 10/1). Mean ± SEM ( n = 3-4). * P <0, 05 mot kontroll, ° P <0, 05 mot 0, 5 / 1 forhold per celle ( n = 3-5)

Full størrelse bilde

Effekten av PM ap på adhesjon av primære monocytter ble undersøkt under fysiologiske forhold med lavskjærstrømning over et sammenflytende monolag av humane endotelceller. 17 Coincubation med PM ap (44 timer) stimulerte dramatisk adhesjonen av isolerte monocytter til endotelet, mens saminkubasjon med blodplater på lignende teller ikke hadde noen effekt (figur 3d). Behandling med PM ap stimulerer således klebemiddelegenskapene til både den monocytiske cellelinjen og primære monocytter.

PM ap- indusert differensiering til faglige hjemmehørende fagocytter

Endringer i monocytiske celleoverflate-reseptorer ble undersøkt ved hjelp av flytcytometri etter kortvarig (44 timer) eller lang sikt (7 dager) inkubasjon med eller uten PM ap . Tilstedeværelsen av PM ap økte gradvis ekspresjonsnivåene av CD11b (integrin αMβ2 ), CD14 (lipopolysakkarid-co-reseptor) og CD31 (blodplate-endotelcelleadhesjonsmolekyl-1) på lignende måter for THP-1-celler (figur 4a) og for primære monocytter (figur 4b). Nærværet av PM ap nedregulerte ekspresjonen av CCR2 (CCL2-reseptor) både på THP-1-celler og monocytter etter 44 timer, selv om ekspresjonen av denne reseptoren ble gjenvunnet etter 7 dager. I motsetning til dette økte PM ap signifikant nivået av CCR5 (CCL5-reseptor) i THP-1-celler, men ikke i primære monocytter, og økte nivået av CXCR4 (CXCL12-reseptor) både i THP-1-celler og primære monocytter (figur 4a og b). Felles for dette antydet at PM apbehandlede monocytiske celler pleier å anta en resident (M2) monocytfenotype, som tidligere er blitt definert som CD14 + CD16 + CCR2 - CCR5 + CXCR4 ++ . 18 Ekspresjonsnivåer av CD16 (FcγRIII-reseptor) forblir uforandret i våre eksperimenter (figur 4a og b).

Endret uttrykk av lim og kjemokinreceptorer indusert av PM ap . THP-1-celler ( a ) eller primære monocytter ( b ) ble inkubert med vehikelkontroll eller PM ap (forhold per celle, 10/1), i hovedsak som beskrevet for figur 2. Etter 44 timer eller 7 dager inkubasjon ble ekspressjonsnivåer FI) av de adhesive GP, CD11b, CD14 og CD31, og av kjemokinreceptorene, CCR2, CCR5 og CXCR4 ble bestemt ved hjelp av flytcytometri. Mean ± SEM ( n = 4-7). * P <0, 05 versus kontroll

Full størrelse bilde

Langvarig inkubering av THP-1-celler med PM ap stimulert spredning av cellene på en fibronektinoverflate (figur 5a). Spredning involverte dannelsen av filopoder og lamellipoder, som dukket opp som actinfilamentbunter ved farging med actinproben, phalloidin (figur 5a). Det ble også funnet at nærværet av PMap i det vesentlige annullerte proliferasjonen av THP-1-celler (figur 5b). Kontrollfarging med etidiumbromid viste at de ikke-levedyktige celler forblir ved 6-7% etter behandling med PMA, PM ap eller hvilende blodplater (figur 5c). Samlet støttet disse funnene konklusjonen om at THP-1-celler i nærvær av PM ap utvikler seg til en bosatt, ikke-proliferativ fagocytisk fenotype.

Differensiering av monocytter til residente fagocytiske celler indusert av PM ap . ( a ) Overflatespredning og aktin-cytoskelettomlegginger av THP-1-celler, dyrket i 7 dager med bærerbuffer eller PM ap . Lysfeltbilder viser cellefordeling og filopoddannelse (piler); bilder av FITC-phalloidin-fluorescens viser tråder av aktinfilamenter med PM ap (målestenger: 100 μm, representativ for tre eksperimenter). ( b ) Spredning av THP-1-celler etter 7 dager inkubasjon med vehikel eller PM ap . Data uttrykkes som absolutte celle tall. ( c ) Relativ mengde (%) av nekrotiske celler etter inkubering med PMA (10 ng / ml), PM ap eller hvilende blodplater. ( d ) Opptak av oxLDL (merket med DiI) av THP-1-celler, inkubert i 7 dager med PM ap eller hvilende blodplater (plts). ( e og f ) Ekspression av fagocytiske cellemarkører på THP-1-celler ( e ) og primære monocytter ( f ). Celler ble behandlet i 2 eller 7 dager med vehikel eller PM ap . Overflateekspresjon av CD36 ble bestemt ved hjelp av flytcytometri, som det var den intracellulære ekspresjon av CD68 i permeabiliserte celler. Inkubasjonsbetingelser var som beskrevet for figur 2. Gjennomsnitt ± SEM ( n = 4-5). * P <0, 05 versus kontroll

Full størrelse bilde

Ytterligere eksperimenter ble utført for å bekrefte differensieringen i faglige fagocytiske celler. Langvarig 7-dagers inkubering av THP-1-celler med PM ap, men ikke med hvile blodplater, økte opptaket av oksidert lavdensitetslipoprotein (oxLDL; Figur 5d). I samsvar med dette ble overflateekspresjonen av de respektive oxLDL- og LDL-reseptorene CD36 og CD68 (makrofagdifferensieringsmarkører) økt i nærvær av PM ap (Figur 5e). På samme måte økte inkubasjon av primære monocytter med PM ap i 7 dager CD36-nivået, men denne perioden syntes å være for kort til å endre CD68-ekspresjonen (figur 5f).

PM ap- induserte sekretoriske egenskaper av monocytiske celler

Residens fagocytiske monocytter karakteriseres av deres evne til å utskille matriksnedbrytende proteinaser og reaktive oksygenarter. 19 Inkubasjon av THP-1-celler med PM ap, men ikke hvilende blodplater, førte i virkeligheten i produksjon av funksjonell matriksmetalloproteinase (MMP) 9, som vist ved zymografi (Figur 6a). Kvantifisering av zymogrammer indikerte en tidsavhengig økning av MMP-aktivitet etter PM ap inkubasjon, som var like høy som inkuberingen med PMA etter 7 dager (Figur 6b). Denne tids-effekten indikerte også at MMP avledet fra PMap og blodplater 20 selv ikke målbart bidro til den zymografiske aktivitet av supernatanter. Videre økte PM ap inkubasjon markant utslipp av hydrogenperoksid (H202) fra begge monocytiske celler (Figur 6c) og primære monocytter (Figur 6d).

Sekreterte produkter av monocytter indusert av PM ap . ( a og b ) Økning i MMP9 kollagenolytisk aktivitet i supernatant av THP-1-celler, etter inkubering med vehikelkontroll (ctrl), PMA (10 ng / ml), PM ap eller hvilende blodplater (plts) i 44 timer eller 7 dager. ( a ) Representative inverse zymogrammer av supernatanter underkastet gelelektroforese; Merk mørke fordøyelsesbånd ved 260 kDa og 98 kDa. ( b ) Densitometrisk kvantifisering av gelatinolytisk aktivitet av 98-kDa båndet (gjennomsnittlig grå verdi). Vær oppmerksom på at gråverdien er omvendt korrelert med proteaseaktivitet. ( c og d ) Kvantifisering av H202-produksjon etter 20-44 timer inkubering i supernatanter fra THP-1-celler ( c ) eller monocytter etter 44 timer ( d ). Parallelle tester ga fraksjoner av ikke-levedyktige celler på <0, 3% (44 timer) for THP-1 og monocytter etter henholdsvis 7 dager 6-7% eller 2-3% under alle forhold. Mean ± SEM ( n = 3). * P <0, 05 versus kontroll

Full størrelse bilde

For å skjerme for utskillelsen av cytokiner og kjemokiner ble primære monocytter inkubert i 44 timer med PM ap eller hvile blodplater, hvoretter celle supernatanter ble analysert for nærvær av et panel av cytokiner ved bruk av et halvkvantitativt kommersielt array kit (figur 7a) . Markert, i forhold til blodplater, stimulerte tilstedeværelsen av PM ap frigivelsen av flere cytokiner og andre faktorer som er kjent for å være proinflammatoriske, slik som C5a, CCL5 og interleukin-23, og i mindre grad av makrofagemigreringsinhiberende faktor, oppløselig CD40-ligand og løselig intercellulær adhesjonsmolekyl 1. Videre produserte monocytene flere faktorer som deltar i immunmodulerende og regenerative prosesser i stedet for i betennelse, slik som granulocytkolonistimulerende faktor (G-CSF) og granulocyt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) . For å bestemme de mest utspridde relevante cytokiner på en mer kvantitativ måte, utførte vi en enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for C5a, GM-CSF, interferon- y (IFN- y ) og tumornekrosefaktor a (TNF α ). Selv om utsöndrede IFN- y- nivåer var under deteksjonsgrenser, bekreftet ELISA-målingene i stor grad induksjonen av monocytt C5a, GM-CSF og TNF α- sekresjon ved PM ap, omend at blodplater mer potensielt induserte GM-CSF-produksjon i monocytter enn PM ap (Figur 7b).

Sekretærprofil og konsentrasjonsanalyse av cytokinmediatorer produsert av monocytter som interagerer med PM ap eller blodplater. Monocytter på fibronektinbelagte plater (3 x 105 celler / brønn, eller 1, 5 x 106 celler / ml) ble coinkubert med vehikelkontroll (ctrl), PM ap (1, 5 x 107 celler / ml) eller hvilende blodplater (plts, 1, 5 x 107 celler / ml) i 44 timer. Supernatanter ble analysert ( a ) for et panel av bioaktive mediatorer ved bruk av et cytokin array kit, og data ble uttrykt som prosentvise forskjeller sammenlignet med en vehikelkontroll eller ( b ) konsentrasjonsbestemmelse av C5a, GM-CSF, IFN- y og TNF α ved konvensjonell ELISA. Mean ± SEM ( n = 3), * P <0, 05 mot kontroll, ° P <0, 05 mot blodplater

Full størrelse bilde

Diskusjon

I dagens papir har vi identifisert en potent modulerende rolle PM ap på monocytfunksjoner. Disse mikropartiklene, dannet ved å aldre blodplater i en apoptose-lignende prosess, ser ut til å vise en karakteristisk "klebende" membranoverflate med integriner (GPIIb / IIIa) i aktivert konformasjon og eksponering av fosfatidylserin, som kan lette samspillet med monocytter. I litteraturen blir dannelsen av blodplate-leukocytkatalysatene studert omfattende, for eksempel, etter aktivering av blodplateproteaseaktivert reseptor (trombinreceptor) og P2Y12-reseptorer. Veldig lite er imidlertid fortsatt kjent om dannelsen av blodplate-mikropartikkel-leukocytkomplekser. Den foreliggende studien er den første som demonstrerer rollen av blodplate-mikropartikler, produsert fra aldring, og apoptotiske blodplater i leukocyttfunksjon og differensiering. Felles viser resultatene at PM ap interaksjon med monocytiske celler og primære monocytter fremkaller kraftige effekter ved å oppnå cellepolarisering og differensiering. I vår implementerte modell for saminkubasjon av blodplater og PM ap med monocytiske celler in vitro, tok vi anstrengelse for å utelukke forvirrende effekter av PM ap generert av blodplater under den langsiktige kultursystemet. Faktisk ble mengden spontant generert PM ap ved blodplater funnet å være funksjonelt ubetydelig.

De nøyaktige signalveiene som utløses i monocytter av PM ap, må fortsatt identifiseres. En tenkelig mekanisme som støttes av våre funn, utløses via kjemokiner som CCL5, som bæres og utskilles av aktiverte blodplater 16, 21, 22 og aktiveringsinducerte blodplate-mikropartikler. 14, 23 En slik mekanisme forklarer den kjemotaktiske effekten av PM- ap som forårsaker monocytisk celle-migrasjon og har nylig vært underforstått i moduleringen av T-celledifferensiering av blodplater. I tillegg er PM-indusert aktivering av monocytter avhengig av spesifikke molekylære interaksjoner med reseptorer på mikropartikkeloverflaten, inkludert lipider (fosfatidylserin), 25, 26 klebemiddelreceptorer (for eksempel aktiverte GPIIb / IIIa) og GP-motreceptorer (P-selektin), ligner de som er identifisert for monocytaktivering med blodplater. 22, 27 Dessuten kan endocytose av PM ap etter adhesjon tvinge monocytene til å gå inn i spesifikke differensieringsveier. Interessant viste det seg at PM- ap- indusert adhesjon til monocytiske celler ble avskaffet ved cellebehandling med wortmannin, noe som tyder på en rolle av fosfonositid-3-kinase signalveier i monocytaktivering (E. Vasina, upubliserte data og Barry et al. 28 ) .

Sirkulerende monocytter ser ut til å danne forskjellige undergrupper med diskrete egenskaper og funksjoner. En konvensjonell deling er i "proinflammatoriske" M1-monocytter, som utskiller proinflammatoriske cytokiner og har en cytotoksisk rolle, og "resident" M2-monocytter, som deltar i vevsmodellering, sårheling og angiogenese. 29 M2-monocyttene har en tendens til å skille seg fra profesjonelle fagocytter karakterisert ved sterk endocytotisk aktivitet. 18 Å vite at dannelsen av residente monocytter ledsages av nedregulering av CCR2 og oppregulering av CCR5 og CXCR4 overflate reseptorer, observerte vi et markert potensial for PM ap for å skille monocytter i retning av M2 celler og profesjonelle fagocytter. Dette ble bekreftet ved et økt uttrykk av klebemiddelinteg-liner (CD11b), av de respektive LDL- og oxLDL-reseptorene, CD68 og CD36, og en høyere opptak av oxLDL. Til støtte for oppfatningen om at M2-monocytter fortrinnsvis differensierer til dendritiske celler, oppdaget vi 18 forhøyede mengder GM-CSF i sekretomet av PM-apstimulerte monocytter, et stimulus for differensiering til dendritiske celler. 30

De foreliggende funnene har sannsynligvis viktige implikasjoner for vår forståelse av aterosklerosens patologi. Initial støtte for en proaterogen rolle av PM ap- aktiverte monocytter kommer fra deres forbedrede adhesjon til endotelceller under strømningsbetingelser som går foran plakkinfiltrering og er spesielt relevant i tidlige stadier av aterosklerose. 16 Denne økte adhesjon er sannsynligvis mediert av reseptorer på mikropartiklene eller ved økt ekspression av klistermonoksyreceptorer (for eksempel CD11b, CD31) 22, 31 og kan ytterligere forsterkes ved ekspresjon av kjemokiner, slik som CCL5. 23 I tillegg ble monocyt-delmengden LyC lo CCR2 - CCR5 + vist for å bruke CCL5-reseptoren CCR5 ved å gå inn i aterosklerotiske plakker i mus, 32 og blokkering av CCR5 førte til reduksjon av aterosklerose i flere studier. 33 Analogt, i våre eksperimenter, er polariseringen av humane monocytter ved PM ap i CD14 + CD16 + CCR2 - CCR5 + CXCR4 ++ fenotypen suggestiv for dannelsen av en proaterogen monocyt-subset, som bor i menneskelige plakker og forverrende aterosklerose. Dette forslaget støttes av observasjonen at PM ap- aktiverte monocytiske celler oppregulerer ekspresjonen av fagocyttmarkører (CD14, CD36, CD68) og massivt frigjør MMP og H202, som er faktorer som utgjør plakk destabilisering og eventuelt brudd, en klinisk utfellende hendelse i aterosklerotisk sykdom.

Tidligere studier har vist at produksjonen av PM ap er en kontinuerlig prosess i lagrede blodplater i det tilsynelatende fraværet av blodplateaktivering. 10 I sirkulasjonen, som andre apoptotiske legemer, fjernes disse mikropartiklene aktivt ved binding og fagocytose. 11 Det er mulig at denne fjerningen medieres av interaksjoner av PM ap med leukocytter, spesielt monocytter. Faktisk kan koagulater av blodplatefragmenter og monocytter detekteres i blod fra friske individer (E. Vasina, upubliserte data). På den annen side kan slike interaksjoner bidra til langvarig leukocytdifferensiering, som vi har påpekt i dette papiret, og kan til og med være en polariserende faktor i utviklingen av residente monocytter. Imidlertid må det gjøres ytterligere arbeid for å demonstrere at PM ap- primerte monocytter skiller seg inn i M2-celler og bosatt makrofager / dendritiske celler in vivo .

De foreliggende resultater til og med antyder at PM ap har et immunmodulerende potensial ved å stimulere sin egen fagocytiske fjerning, idet CD11b, CD1434 og CD36 25 alle har blitt involvert i opptak av apoptotisk materiale. Dette forslaget er bekreftet av overflod av proinflammatoriske og ikke-inflammatoriske cytokiner, inkludert G-CSF, GM-CSF og TNF α, som utskilles ved PM ap- kontakt med monocytter. Til slutt er dette den første studien som viser at mikropartikler som spontant oppstår fra apoptotiske blodplater, er i stand til å fremme monocytter mot en resident fagocytisk fenotype, forandrer deres oppførsel og aktiveringstilstand, og presenterer dermed en ny mekanisme hvor blodplater og deres produkter kan påvirke progresjon av aterosklerotisk sykdom.

Materialer og metoder

Monocytiske celler og primære monocytter

Humant akutt monocytisk leukemi THP-1-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium med L-glutamin og 10% føtalt bovint serum (FBS). MC ble oppnådd fra buffy frakker av perifert blod fra raske menneskelige givere som ga informert samtykke. Monocytter ble separert fra nøytrofiler ved hjelp av Ficoll-densitetsgradient-sentrifugering og ytterligere isolert ved negativt utvalg ved bruk av et MACS monocyt isolasjonskit II (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Tyskland), i henhold til produsentens protokoll. Renheten av monocyttpreparatet ble analysert ved hjelp av flytcytometri basert på cellespredning og sidestrømning og utgjorde> 97%.

Blodplateavledede mikropartikler og vasket blodplater

PM ap ble isolert fra blodplate-konsentrater i plasma, som ble lagret i 5 dager under standardblodbankforhold (Uniklinikum Aachen, Tyskland). Blodplater ble fjernet ved hurtig sentrifugering ved 4000 x g i 5 minutter. De blodplasfrie plasmapreparatene ble sentrifugert ved 20 000 x g i 60 minutter. Pellets inneholdende PM ap ble resuspendert i Hepes buffer pH 7, 45 (136 mmol / l NaCl, 10 mmol / l Hepes, 2, 7 mmol / l KCl, 2 mmol / l MgCl2, 0, 1% bovint serumalbumin og 0, 1% glukose), filtrert gjennom et 0, 8 μm filter for å fjerne resterende blodplater og pelleteres igjen ved 20 000 x g i 40 minutter. Supernatanter ble brukt for kontrollforsøk. Etter resuspendering av pelleten i Hepes-buffer, ble PM ap merket med anti-CD61-FITC mAb (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland) telt ved hjelp av flytcytometri i nærvær av faste tall på 6 μm kalibreringskuler (BD Biosciences). Hendelsesstørrelser ble estimert ved tilsetning av 1 μm og 6 μm fluorescerende perler (Polysciences, Eppelheim, Tyskland). CD61-positive hendelser <6 μm ble talt som PM ap . Suspensjoner av PM ap ble direkte brukt eller snapsfrosset i flytende nitrogen. Den isolerte PM ap var praktisk talt negativ for eksosomarkøren CD63.

Blodplater ble isolert fra ferskt oppnådd humant blod, som beskrevet. 35

Flowcytometrisk bestemmelse av celleoverflate markører

Ved hjelp av flytcytometri på en fluorescensaktivert cellesortering Canto II (BD Biosciences) ble blodplater og PM ap karakterisert for overflateproteinivåer med fluorescensmerkede antistoffer mot CD61, CD62P eller aktivert GPIIb / IIIa (PAC-1mAb; BD Biosciences). Ekspresjon av fosfatidylserin ble probet med APC-annexin A5 (BD Biosciences). THP-1-celler eller monocytter i suspensjon ble farget (30 minutter, 4 ° C) med anti-humane antistoffer mot musen CD11b, CD31 (Sigma, St. Louis, MO, USA); CD14, CD16, CCR2, CCR5, CXCR4 (BD Biosciences); eller CD36 (ImmunoTools, Friesoythe, Tyskland) og fremstilt som beskrevet tidligere. 36 Intracellulær CD68 ble detektert i celler fiksert med paraformaldehyd, permeabilisert med 0, 5% Triton-X-100 og farget med mus anti-humant CD68mAb (BD Biosciences). Tilsvarende negative kontrollantistoffer var IgG1 (Sigma); IgG2b, K (BD Biosciences) eller IgG2a (ImmunoTools) og brukes ved anbefalte fortynninger. Ekspresjonsnivåer presenteres som geometriske midler for fluorescenshistogrammer, korrigert for verdiene oppnådd med isotype-kontrollantistoffer og som representative histogrammer (FlowJo-programvare, Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA).

Adhesjon av monocytiske celler

Adhesjon av THP-1-celler ble målt i RPMI-1640 medium tilsatt 5% FBS, som beskrevet. 37 Celler behandlet med vehikel, PMA (10 ng / ml, Calbiochem, Darmstadt, Tyskland), blodplater eller PM- ap, ble igjen å feste seg til fibronektinbelagte brønner ved 37 ° C. På angitte tidspunkter ble vitale celler merket med BCECF-acetoksymetylester (1 μg / ml, Sigma) i 1 time, hvorefter fluorescens ble målt på alle celler og på adherente celler etter en vask ved hjelp av en Spectra FluoPlus-leser (Tecan, Männedorf, Sveits). Adhesjon ble uttrykt som prosentandel av fluorescens av alle celler. Inkubasjoner ble utført i tre eksemplarer. I parallelle eksperimenter ble merkede celler skrapt fra brønner og tellet via kalibrerte strømningscytometri, med i det vesentlige de samme resultater.

Adhesjon av primære monocytter til et monolag av humane aorta endotelceller (passasje 6-7) under strømningsbetingelser (0, 1 ml / min, 1, 5 dyn / cm2) ble målt ved mikroskopisk videoavbildning. 17 celler ble preinkubert med Hepes buffer (vehikel), PM ap eller blodplater i 44 timer ved 37 ° C. Under perfusjon ble adherente monocytter telt i minst fem tilfeldige mikroskopiske felt.

Transwell-celle-migrasjonsanalyse

I 5- μm pore Transwell-plater (Corning Life Sciences, Lowell, MA, USA) ble bunnkamrene fylt med vehikel, CCL2 (50 ng / ml, PeproTech, Hamburg, Tyskland) eller PM ap (108 celler / ml) alene eller sammenføyet med isotype-kontroll (IgG1) eller blokkerende antistoffer mot CCL5 eller CXCL7 (10 μg / ml, 40 min ved RT, alt fra R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) i RPMI-1640 medium. Øvre kamre inneholdt THP-1-celler i RPMI-1640 medium med 5% FBS (3 x 104 celler / brønn). Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene i bunn og øvre brønner telt ved kalibrert strømningscytometri. 38 Assays ble kjørt i tre eksemplarer. Prosentandeler av transmigrerte celler ble beregnet. Totale celleverdier forblir uforandret ved de forskjellige inkubasjonsbetingelsene.

Monocytcellefunksjonsanalyser

Spredning av THP-1-celler ble målt etter dyrkning i RPMI-1640 medium med 5% FBS ved 37 ° C. Celler ble podet i 96-brønnsplater (3 x 104 celler / brønn, eller 1, 5 x 105 celler / ml), belagt med fibronektin og stimulert, som beskrevet. Ved angitte tider ble adherente celler merket med DAPI (0, 5 μg / ml i 1 time ved 37 ° C), og fluorescens ble målt i en Spectra FluoPlus plate-leser. Kalibreringer med kjente celleteller ble utført for å konvertere fluorescensverdier til celle tall. Parallelt ble fraksjoner av levedyktige celler bestemt mikroskopisk ved å fargelegge levedyktige celler med kalceinacetoksymetylester (1 μg / ml) og motfarging lekkede, ikke-levedyktige celler med etidiumbromid (1 μg / ml). Fraksjoner av ikke-levedyktige THP-1-celler var <0, 3% etter 44 timer og 6-7% etter 7 dager, uavhengig av nærvær eller fravær av PMA, blodplater eller PM ap .

Binding og opptak av oxLDL ble bestemt i brønner med 24 brønner. THP-1-celler (8 x 105 celler / ml) ble inkubert med PM ap (8 x 106 celler / ml), hvilende blodplater (8 x 106 celler / ml) eller PMA (10 ng / ml). På tidspunktet av interesse ble DiI (1, 1 ', dioktadecyl-3, 3, 3'3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat) -merket oxLDL (25 μg / ml) coinkubert i 4 timer. Etter merking ble reserpensjonerte celler resuspendert i fosfatbuffert saltløsning inneholdende 5 mmol / l etylendiamintetraeddiksyre og latt i 15 minutter ved romtemperatur (RT) for å tillate dissosiasjon av overflatebundet oxLDL. Etter et vaske-trinn (sentrifugering ved 300 x g i 10 min) ble fluorescens analysert ved hjelp av flytcytometri (phycoerythrin-kanal). Oksidert LDL og DiI-merket oxLDL ble fremstilt fra poolet humant plasma og merket som beskrevet. 39

Actinfilamenter i dyrkede THP-1-celler ble bestemt etter fiksering, permeabilisering og farging med fluorescensmerket FITC (fluoresceinisothiocyanat) -faloidin (1 mg / ml i 15 minutter, Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) som beskrevet tidligere. 10

Bestemmelse av monocyttcellesekretjonsprodukter

For å vurdere for utskilt MMP ble cellesupernatanter utsatt for akrylamidgelelektroforese, og den kollagenolytiske aktivitet i geler ble bestemt ved klassisk zymografi. Producerte H202 i celle-supernatanter ble kvantifisert fra omdannelseshastigheten av tetrametylbenzidinsubstrat med et kit fra Calbiochem.

Human primary monocytes in fibronectin-coated well plates were incubated with PM ap or platelets for 44 h (37 °C). Supernatants were analyzed for secreted mediators using a commercial human cytokine array kit (R&D Systems) for proteome profiling of secreted cytokines or conventional ELISA kits for C5a (R&D Systems), GM-CSF (PeproTech), IFN- γ and TNF α (both from eBioscience, San Diego, CA, USA).

Electron and confocal microscopy

Platelets or PM ap, alone or coincubated with THP-1 cells, were immobilized on poly-lysine surfaces, and fixed with 4% paraformaldehyde. After overnight dehydration, samples were subjected to scanning electron microscopy, as described. 40 PM ap were labeled with anti-human CD61-FITC mAb (BD Biosciences) for 1 h and then coincubated with THP-1 cells (1 × 10 6 cells/ml) for 4 h. Afterwards, the cells were labeled with a leukocyte marker anti-human CD45-APC mAb (eBioscience) for 40 min (all incubations at RT). Finally, the cells were mounted on a coverslip without fixation and visualized using a 2100 MP (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) microscope set in confocal mode.

statistiske analyser

Data are given as mean±SEM Differences with P <0.05 were considered to be statistically significant (Student's t -test or analysis of variance where applicable).

Endre historie

Tilleggsinformasjon

videoer

  1. 1.

    Supplerende film

Word-dokumenter

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

Ordliste

APC

allophycocyanin

BCECF

2, 7-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein

C5a

complement component 5a

DII

1, 1′, di-octadecyl-3, 3, 3′3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

ELISA

enzymbundet immunosorbentanalyse

FBS

fetal bovine serum

FI

fluorescent intensity

FITC

fluorescein-isotiocyanat

GM-CSF

granulocyte macrophage colony-stimulating factor

GP

glycoprotein

H202

hydrogenperoksid

IFN- y

interferon- y

LDL

low-density lipoprotein

oxLDL

oxidized low-density lipoprotein

PMA

phorbolmyristatacetat

PM ap

apoptosis-induced platelet microparticles

RT

room temperature

SEM

standard feil av gjennomsnittet

TNF a

tumor necrosis factor α

Supplerende informasjon følger med på papiret på Cell Death and Disease nettsted (//www.nature.com/cddis)

Anbefalt Redaksjonens