Anonim

Temaer

  • Biofysisk kjemi
  • Photosystem II

Abstrakt

PsbP-proteinet, en ekstrinsisk underenhet av fotosystem II (PSII) i grønne planter, er kjent for å indusere en konformasjonell forandring rundt den katalytiske Mn 4 CaO 5- klyngen som sikrer bindingen av Ca 2+ og Cl - in PSII. PsbP har flere interaksjoner med membranunderenhetene til PSII, men hvordan disse påvirker strukturen og funksjonen til PSII krever avklaring. Her fokuserer vi på interaksjonene mellom de N-terminale rester av PsbP og a-underenheten av cytokrom (Cyt) b 559 (PsbE). En nøkkelobservasjon var at et peptidfragment dannet av de første N-terminale 15 rester av PsbP, 'pN15', var i stand til å konvertere Cyt b 559 til sin HP-form. Interessant redusert tilsetning av pN15 til NaCl-vasket PSII-membraner PSIIs oksygenutviklende aktivitet, selv i nærvær av mettende Ca 2+ og Cl - ioner. Faktisk hemmet pN15 reversibelt S 1 til S 2- overgangen til OEC i PSII. Disse dataene antyder at pN15 kan modulere redoksegenskapen til Cyt b 559 involvert i sidelektronbanen i PSII. Denne potensielle endringen av Cyt b 559, i fravær av det C-terminale domenet til PsbP, ville imidlertid forstyrre hvilken som helst elektrondonasjon fra Mn 4 CaO 5- klyngen, hvilket fører til muligheten for at flere interaksjoner av PsbP, bindende til PSII, har forskjellige roller i regulering av elektronoverføring innenfor PSII.

Introduksjon

De oksygenutviklende reaksjonene er en grunnleggende komponent i livet og kritisk for den evolusjonære suksessen som ligger til grunn for konvertering av sollys til kjemisk energi. Denne kjemi utføres i et mikro-miljø med protein-ligand-kofaktor som kalles oksygen-evolvingskomplekset (OEC), som strekker seg ut fra den lumenale overflaten av membranbundet fotosystem II (PSII) 1 . Mye fremskritt har blitt gjort for å bestemme strukturen av PSII-komplekset, og nyere røntgenstrukturanalyse av det prokaryote, cyanobakterielle, PSII-komplekset ved atomoppløsning har avslørt plasseringen av> 20 membran-inneboende og -ekstrinsiske proteinunderenheter, pigmenter og redoks-koaktorer, inkludert en metallklynger av fire Mn-ioner, Ca 2+ og fem okso-ligander, kalt sammen Mn 4 CaO 5- klyngen 2, 3 .

Lys excitering av den primære donor P680, et spesielt par klorofyll (Chl) a dimerer i PSII, fører til primærladnings separasjon og påfølgende elektronoverføring til et nærliggende fenofytin, som følges av ytterligere elektronoverføring via to kinoner, QA og Q B. Det oksidative hullet som gjenstår på P680 overføres til Mn 4 CaO 5- klyngen via en redoksaktiv tyrosin, Tyr 161, på D1-underenheten. Mn 4 CaO 5- klyngen konverterer to vannmolekyler til ett molekyl med oksygen og fire protoner gjennom en lysdrevet syklus bestående av fem mellomprodukter kalt S i- tilstander ( i = 0-4) 4 . Blant dem er S 1- tilstanden den mest mørkestabile, og blitsbelysning forløper hver S jeg sier ( i = 0-3) til neste S i + 1- tilstand. Molekylært oksygen frigjøres under S3-S4-S0-overgangen etter transient S4-tilstand 5 .

I tillegg har PSII en sidelektronbane formidlet av minst Cyt b 559, dannet av PsbE- og PsbF-underenhetene, karotenoider og en klorofyll, Chlz, som sammen fungerer som en sikkerhetsventil for å fjerne det overskytende oksidative hullet fra donor side, selv om detaljene i denne sidelektronbanen fortsatt er gjenstand for mye debatt 6 . Cyt b 559 er kjent for å ha flere former som avviger i deres redokspotensial: den høye potensielle (HP) form, mellompotensial (IP) form og lavpotensial (LP) form 7 . Det har blitt antatt at Cyt b 559 kan interconvertere blant sine forskjellige redokstilstander avhengig av enhver pågående inhibering av donor- og akseptor-side av PSII, og bidrar dermed til beskyttelse av PSII fra fotodamasje 8 .

Sammensetningen av membran-inneboende PSII-kjerneunderenheter er sterkt konservert blant foto-oksygenorganismer, mens sammensetningen av det ektrinsiske proteintomene har gjennomgått signifikant forandring under utvikling 9 . Grønne planter, inkludert høyere planter, har et sett med tre ekstrinsiske proteiner, PsbO, PsbP og PsbQ 10 . I motsetning har cyanobakterier PsbO til felles, men har PsbV (Cyt c 550 ) og PsbU i stedet for PsbP og PsbQ 11 . Det har også blitt rapportert at cyanobakterier har PsbP- og PsbQ-homologer, betegnet CyanoP og CyanoQ 12 . Den nåværende oppfatningen er at PsbV og PsbU har gått tapt under utviklingen, og PsbP og PsbQ i grønne planter ser ut til å ha utviklet seg fra CyanoP og CyanoQ, henholdsvis 13 . Videre har høyere planter flere homologer av PsbP og PsbQ. I Arabidopsis ble to PsbP-proteiner (PsbP1 og PsbP2), to PsbQ-proteiner (PsbQ1 og PsbQ2), to PsbP-lignende proteiner (PPL1 og PPL2), syv PsbP-domeneproteiner (PPD1-7) og tre PsbQ-lignende proteiner PQL1-3) er identifisert 14 . Genetiske studier med Arabidopsis-mutanter har vist at PsbP- og PsbQ-homologer faktisk er involvert ikke bare i PSII-regulering og PSII-reparasjon, men også i kloroplast NDH-aktivitet og PSI-samling 15, 16 . Imidlertid er den nøyaktige grunnen til hvorfor grønne planter har utviklet PsbP og PsbQ, spesielt for binding til PSII, fortsatt å besvare 17 .

Den molekylære funksjonen av PsbP og PsbQ proteiner har blitt studert både in vitro og in vivo . For det første har in vitro frigjørings-rekonstitusjonsforsøk ved hjelp av isolerte oksygenutviklende PSII-membraner vist PsbP og PsbQ for å være ansvarlig for oppbevaring av Ca2 + og Cl - innenfor OEC er essensielle kofaktorer for oksygenutviklende eller vann- splitting, reaksjoner 18, 19 . Fouriertransform infrarød (FTIR) differensspektroskopi har uttalt at PsbP, men ikke PsbQ, induserer konformasjonelle endringer rundt Mn 4 CaO 5- klyngen for å modulere bindingsegenskapene til Ca 2+ og Cl - 20 . Analyse av knockout og knockdown planter har vist at PsbP er essensielt for plantefoto-autotrofi og montering av PSII 21, 22, 23, 24, mens PsbQ bare er nødvendig for PSII-stabilitet under svake lysforhold 25 . Derfor er samspillet mellom PsbP og PSII spesielt viktig for å optimalisere og forbedre oksygenutviklingen, mens PsbQ har en hjelpefunksjon for å stabilisere funksjonell interaksjon av PsbP med PSII 26 .

Nylige kjemiske tverrbindingsforsøk ved bruk av 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) antyder at PsbP har flere interaksjoner i en høyere plante PSII superkompleks; PsbP interagerer direkte med Cyt b 559 a-underenheten (PsbE-proteinet) via N-terminalen, og også med PsbR 27 . I tillegg samhandler PsbP med både CP26 og CP43 lyshøstende proteiner via aminosyrerester lokalisert i sitt C-terminale domene 28 . Vi har tidligere rapportert at PsbP-A15, hvor de sterkt konserverte N-terminale 15-residuene blir avkortet, mister evnen til å indusere konformasjonell endring av protein rundt Mn 4 CaO 5- klyngen og fremkalte ingen oksygenutvikling 20, 29 . Denne N-terminale sekvensen av PsbP er usynlig i de nåværende strukturelle modellene og bør ta en forlengende fleksibel struktur 30, 31 . Bindingen av PsbQ kan imidlertid gjenopprette funksjonen til PsbP-A1526, hvilket indikerer at den N-terminale sekvensen av PsbP ikke er nødvendig for oppbevaring av ioner i OEC og kan ha andre funksjoner.

I denne studien undersøkte vi betydningen av samspillet mellom PsbP og PSII via N-terminalen. Redusert-minus-oksidert spektra av Cyt b 559 viste at den redoks-potensielle endringen av Cyt b 559 forekommer ved assosiasjon av innfødt PsbP-protein, men ikke ved N-terminalt avkortet PsbP. Oppsiktsvekkende påvirker et syntetisk pN15-peptid, som består av PsbP N-terminale 15 rester, strukturen av Cyt b 559 på en transmembran måte og utløser den redoks potensielle forandringen av hemmet i Cyt b 559 . Videre reduserer pN15-peptidet den oksygenutviklende aktivitet av PSII og hemmer S1 til S2-overgangen i OEC foreslått av termoluminescens (TL) og FTIR. Ovennevnte observasjoner indikerer for første gang at en ny mekanisme eksisterer for å modulere redoksegenskapen til Cyt b 559 som samtidig kan påvirke den indre elektronoverføring i PSII ved hjelp av en lumenbundet ekstrinsisk underenhet, PsbP.

resultater

N-terminalsekvensen av PsbP modulerer redokspotensialet til Cyt b 559 i PSII

Figur 1 viser den presumptive bindingsmodellen av den siste røntgenstrukturen av spinat PsbP-protein (PDB ID 4RTI) 31 montert i den cyanobakterielle PSII-strukturen (PDB ID 3ARC) 2 basert på kjemiske tverrbindingsforsøk 27, 28 . Bare membranproteinunderenhetene som ville samhandle direkte med PsbP, er vist. PsbP foreslås å binde til CP43 samtidig som den utvider sin N-terminale sekvens for å interagere med PsbE på den thylakoid-lumenale siden 28 . Selv om de N-terminale 11 rester av PsbP er uordnede, er fraværende fra krystallstrukturen, har de tilstrekkelig lengde for å nå et hvilket som helst sted som er kryssbundet av EDC (Ala 1 i PsbP og Glu 57 i PsbE). En annen modell for PsbP-lokalisering er også blitt foreslått, der den N-terminale sekvensen av PsbP tar en mer kompakt struktur, men fortsatt opprettholder muligheten for å interagere med PsbE 32 . På grunn av disse forskjellene bestemte vi oss for å undersøke effekten av slike interaksjoner, mellom PsbP N-terminalen og PsbE-underenheten av Cyt b 559, på den generelle strukturen og funksjonen til PSII.

Innstilt i et omtrentlig membran domene, er visse inneboende og ekstrinsiske underenheter, CP43 (grå), Cyt b 559 (rød) og PsbP (grønn) vist i tegneseriebåndform. De spesifikke kofaktormolekylene, P680 (grønn), ChlZ (grønn), Q A (blå), Q B (blå), haem (beige), P-karoten (oransje) blir gjengitt i stikkmodellform. Mn 4 CaO 5- klyngen og TyrZ av D1-underenheten (D1-Tyr 161, i rosa) er også presentert, men visualisert som henholdsvis overflate gjengitte sfærer og stangmodeller. Pro 12 i PsbP og Glu 57 i PsbE, vises som stangmodeller, ledsaget av estimerte avstander. UCSF Chimera 62 ble brukt som programvaremodellmiljø.

Full størrelse bilde

For det første ble effekten av foreningen av naturlig PsbP og PsbP-A undersøkt, sistnevnte et mutert PsbP-protein som mangler de siste 9 rester av N-terminalen, men beholder evnen til å aktivere de oksygenutviklende evner av PSII 10, 33 . Spinat PSII-membraner ble behandlet med 1, 5 M NaCl for å fjerne native PsbP- og PsbQ-proteiner, og deretter ble PsbP-proteinet rekonstituert tilbake til de NaCl-vasket PSII-membranene ved et molforhold på 4: 1 (PsbP: PSII) (figur S1) . Alle redoksformer av Cyt b 559 ble først oksidert av ferricyanid, etterfulgt av dens trinnvise reduksjon med hydrokinon, ascorbat og dithionitt, som alle kan overvåkes ved absorpsjonsforskjelsespektroskopi 34 . Et gjennomsnittlig redusert-minus-oksidert spektrum for hver PSII-prøve er vist i figur 2A, og forholdene mellom forskjellige redoksformer av Cyt b 559 er presentert i figur 2B. Intakte PSII-membraner ble observert å inneholde ca. 59% av HP-formen, 32% av IP-form og 9% av LP-formen. I NaCl-vasket PSII-membraner ble HP-innholdet redusert til ca. 34%, og i stedet ble IP- og LP-innholdet økt. På denne måten induserte dissociasjonen av PsbP og PsbQ omdannelsen av Cyt b 559 til den lavere redokspotensialformen, mens rekonstituering av PsbP gjenopprettet HP-innholdet til ca. 58%, som tidligere rapportert 35, 36 . Imidlertid var rekonstituering av PsbP-A9 mindre effektiv ved gjenoppretting av HP-innholdet, hvilket indikerer at den N-terminale sekvensen av PsbP hadde en betydelig rolle i plantens evne til å gjenopprette HP Cyt b 559 til PSII.

( A ) Redusert minus oksidert spektra av Cyt b 559 i ubehandlet (forts.), NaCl-behandlet (NaCl), PsbP-rekonstituert (PsbP), PsbP-A9-rekonstituert (PsbP-A9), pN15-resontitert (pN15 ) og pN15-AA1-rekonstituert (pN15-AA1) PSII membraner. Hydrokinonredusert minus ferricyanidoksidert (1), ascorbat-redusert minus ferricyanidoksidert (2) og dithionitt-redusert minus ferricyanidoksidert (3) differensspekter ble brukt til å estimere mengden av HP, IP og LP former av henholdsvis Cyt b 559 . Hvert spektrum var et gjennomsnitt på tre uavhengige målinger og normalisert til toppen av dithionitt-redusert minus ferricyanidoksidert differensspektrum. ( B ) Relativ innhold av HP, IP og LP former for Cyt b 559 bestemt ved trinnvis reduktiv titrering. Total mengde Cyt b 559 er satt som 100%. Asteriskene indikerer den betydelige økningen av innholdet i HP Cyt b 559 ved rekonstituering. (* p <0, 05, Studentens t- test); n = 3, feilfelt = SEM.

Full størrelse bilde

Overraskende var rekonstitusjon av pN15 alene, et peptidfragment bestående av de første N-terminale 15 rester av PsbP (NH2 -AYGEAANVFGKPKKN-CONH2) ved molforholdet 200: 1 (pN15: PSII) i stand til å gjenopprette mengden av HP-skjemaet til ~ 52% uten å aktivere OEC (fig. S2). Denne effekten ble ikke observert med peptidet da den manglet sin N-terminale Ala 1 (pN15-AA1). Ovennevnte resultater antyder at interaksjonen av den N-terminale sekvensen av PsbP med PsbE, på den lumenale siden av thylakoid, påvirker redoksegenskapene til himmelen av Cyt b 559 på en måte som går gjennom membranen og en som er uavhengig av den oksygenutviklende aktiviteten til PSII.

PN15-fragmentet interagerer med PsbE og endrer konformasjonen av Cyt b 559

For å bekrefte at pN15 interagerer med PsbE i PSII, ble pN15 kryssbundet med PSII ved bruk av EDC, en kjemisk krysslinker. EDC, en nulllengte kryss-linker, kryssbinder en primær amin og en karboksylgruppe når det er elektrostatisk assosiert. Deretter ble de tverrbundne PSII-kompleksene analysert ved SDS-PAGE, og eventuelle kryssbundne produkter ble visualisert ved immunoblotting ved anvendelse av spesifikke antistoffer. Resultatene av immunoblotting, for PSII-membraner kryssbundet i nærvær eller fravær av pN15-rekonstituering, er vist i figur 3. Ingen spesifikt bånd oppstod i PsbO- og Dl-immunblokkene, hvilket indikerer at pN15 ikke påvirket de bestemte underenheter (Fig. .3C, D). Et spesifikt band oppstod i PsbE immunoblotet i nærvær av pN15 ved ca. 11 kDa (figur 3A). Dette båndet ble ikke observert når PSII ble behandlet med EDC i fravær av pN15 og dets intensitet var avhengig av mengden av pN15 anvendt under rekonstituering. Molekylmassen til dette tverrbundne produktet var i overensstemmelse med den teoretiske molekylmasse av pN15-PsbE tverrbundet produkt (MW: 10, 8 kDa).

NaCl-vasket PSII-membraner ble kryssbundet med pN15 ved et molært pN15: PSII-forhold på 50: 1 til 200: 1. For hver prøve ble en mengde protein tilsvarende 3 ug Chl lastet på hver bane og detektert med antisera mot PsbE ( A ), PsbF ( B ), PsbO ( C ) og D1 ( D ). Pilen på ~ 11 kDa indikerer peptidet av pN15 kryssbundet med PsbE. Den stiplede pilen på ~ 13 kDa indikerer det antatte peptidet av PsbE som er kryssbundet med PsbF. De opprinnelige posisjonene til PsbE (9 kDa), PsbF (4 kDa), PsbO (33 kDa) og Dl (32 kDa) underenheter er også indikert.

Full størrelse bilde

Spesielt ble båndets intensitet ved ca. 13 kDa sett å være omvendt korrelert med mengden pN15 anvendt til rekonstituering (figur S3), hvilket indikerer at kryssbinding mellom PsbE og den lille underenheten på ~ 4 kDa ville bli samtidig hemmet av pN15. Det ble utledet at denne tverrbindingspartneren på 4 kDa mest sannsynlig er PsbF-proteinet, partneren til PsbE; sammen danner PsbE og PsbF hele Cyt b 559- enheten 6, 37 . Derfor ble immunoblottende analyse utført ved bruk av antistoffer oppdratt mot PsbF (figur 3B). Faktisk ble et bånd på omtrent 4 kDa identifisert som det for PsbF. Av interesse forsvant dette båndet når PSII ble behandlet med EDC i nærvær av pN15. Dette antydet at når pN15 ble rekonstituert med PSII, gjennomgikk PsbF modifikasjoner av EDC i en slik grad at den ikke lenger ble gjenkjent av peptidantistoffer oppdratt mot PsbF. I samsvar med dette ble det kryssbundne produktet, som forventes å være ca. 13 kDa, ikke detektert i immunoblottene. Det anvendte PsbF-antistoffet anerkjente de N-terminale regioner av PsbF, de som binder redoxhalset på stromalsiden (Fig. S4 og S5). Derfor vil pN15 påvirke strukturen rundt redoxhjernet av Cyt b 559 på en måte som går gjennom membranen.

pN15-peptid reduserer den oksygenutviklende aktivitet av saltvasket PSII-membraner

For å undersøke hvordan PsbP N-terminalen påvirker strukturen og funksjonen til PSII, ble pN15-peptidfragmentet introdusert ved hjelp av rekonstitusjonsstudier og dets virkning på analysen av spaltningsreaksjonen. Den oksygenutviklende evne til rekonstituerte PSII-membraner ble målt i nærvær av 5 mM CaCl2, hvor rekonstituering av PsbP har vist seg å være unødvendig for oksygenutvikling 38, 39 (figur S6). Interessant, ble oksygenutviklingshastigheten for PSII-membraner redusert ved rekonstituering av pN15, selv i nærvær av 5 mM CaCl2, og reduksjonen i oksygenevirkningshastigheten var avhengig av mengden pN15 rekonstituert (figur 4A). Dette demonstrerer at pN15 har en inhiberende effekt på oksygenutviklingshastigheten. Samtidig rekonstituering av pN15 og full lengde (intakt) PsbP inhiberte ikke den oksygenutviklende reaksjonen (figur S6). Dette antyder at intakt PsbP kan eliminere den hemmende effekten av pN15. Derfor var den hemmende effekten av pN15 ikke på grunn av ikke-spesifikk interaksjon med PSII.

( A ) Rekonstituering av forskjellige pN15-fragmenter ble utført ved et molært pN15: PSII-forhold på 50: 1 til 200: 1. PSII-oksygenutviklende aktivitet ble målt i nærvær av 5 mM CaCl2 og 5 mM NaCl, og hastigheten på oksygenutvikling av PSII-membraner uten rekonstituering ble satt til 100% (251 ~ 317 μmol O 2 mg Chl- 1 h - 1 i uavhengige eksperimenter); n = 3, feilfelt = SEM. ( B ) Oksygenutviklende aktivitet av pN15-rekonstituerte PSII-membraner med eller uten vaske-trinn. Rekonstituering ble utført ved et molært pN15: PSII-forhold på 200: 1. Oksygenutviklende aktivitet her ble målt i nærvær av 5 mM CaCl2 og 5 mM NaCl, og oksygenutviklingshastigheten for PSII-membranene uten rekonstituering (kontrollen) ble satt til 100% (261 μmol O 2 mg Chl- 1 h -1 ). Stjernene viser den signifikante forskjellen (* p <0, 01, Studentens t- test); n = 3, feilfelt = SEM.

Full størrelse bilde

Virkningene av pN15-AA1 og andre muterte pN15-peptidfragmenter, hvor den N-terminale Ala 1 ble substituert med andre rester (Gly, Asp, Lys eller Trp) eller en ytterligere Trp-rest ble tilsatt til N- terminalen (vist som henholdsvis A 1 G, A 1 D, A 1 K, A 1 W og WA 1 ), ble også undersøkt. I motsetning til det native pN15-fragmentet viste ingen av disse muterte pN15-fragmenter noen inhiberende virkning på oksygenutvikling, hvilket indikerer at den N-terminale Ala 1 er avgjørende for den hemmeffekten av pN15. Videre ble et pN27-peptidfragment bestående av de første 27 rester av N-terminalen fremstilt og dets rekonstitusjon ble observert for å redusere oksygenutviklingshastigheten ved PSII-membranene på en måte som ligner pN15. Dette viste at en forlengelse av peptidlengde, fra 15 til 27 rester, ikke signifikant forandrer den hemmende effekten av pN15 på vanndeling. Den estimerte dissosiasjonskonstanten (Kd-verdi) av pN15 til PSII-komplekset var ~ 5, 9 x 10-7 M. En slik høy Kd-verdi foreslår absolutt at bindingsaffiniteten til pN15 til PSII-kjernekomplekset er relativt lav.

Tverrbindingsforsøk ved bruk av muterte pN15- og pN27-peptidfragmenter ble også utført (figur S7). Når muterte pN15-peptider ble brukt, ble det tverrbundne båndet på ~ 11 kDa sterkt redusert, noe som antyder at den N-terminale resten av pN15 faktisk er viktig for samspillet med PsbE. Videre, da pN27-peptidfragmenter ble brukt til tverrbindingsforsøk, oppstod det nye båndet på ~ 13 kDa i stedet for båndet ~ 11 kDa. Sammendrag pN15 interagerer med PsbE på samme måte som intakt PsbP og påvirker konformasjonen og samspillet mellom Cyt b 559 underenheter, PsbE og PsbF.

Vi undersøkte neste om hämmende effekt av pN15 på PSII var reversibel eller ikke. PSII-prøven rekonstituert av pN15 ble vasket en gang med bufferen som ble anvendt for rekonstituering, og deretter ble den oksygenutviklende aktivitet målt i nærvær av 5 mM CaCl2 og 5 mM NaCl (figur 4B). Hastigheten for oksygenutvikling av PSII, vasket etter pN15-rekonstituering, ble gjenopprettet til nesten samme nivå av kontroll-PSII-prøven, hvilket indikerer at den inhiberende effekten av pN15 er reversibel. Det antyder også at den ufullkomne inhibering av oksygenutviklende aktivitet ved pN15 også kan være forårsaket av dens partielle dissosiasjon fra PSII ved fortynning med analysebufferen.

pN15 hemmer S1 til S2-overgangen til OEC

For ytterligere å undersøke den inhibitoriske effekten av pN15 på lysinducert ladningsavskillelse innen PSII ble termoluminescens (TL) målinger utført på NaCl-vasket PSII-prøver (kontroll PSII) og pN15-rekonstituerte PSII-membraner (rekonstituering ble utført ved et molforhold av 200: 1) i nærvær av 5 mM CaCl2 og 5 mM NaCl (figur 5A). TL stammer fra et PSII-reaksjonssenter som re-exciteres av en ladningsrekombinasjon på grunn av en økning i temperaturen i prøvene, hvor lysinducerte ladningspar i PSII hadde blitt fritt fanget 40 . B-båndet stammer fra en rekombination av S 2 / S 3- tilstanden, av Mn 4 CaO 5- klyngen, med Q B - 41 . I kontroll PSII ble B-bånd observert rundt 37 ° C, men B-bånd intensiteten i pN15-rekonstituert PSII ble signifikant redusert. Til gjengjeld oppstod det motsatte med pN15-AA 1 moderat redusert intensiteten til B-båndet. Etterpå ble intensiteten til B-båndet for pN15-rekonstituert PSII gjenopprettet til det for kontroll PSII-prøvenivåer ved vasking med buffer, hvilket antyder at pN15 reversibelt hemmer S2 / S3 Q B - ladningsavstanden innenfor PSII (figur S8 ).

( A ) Termoluminescens glødkurver av S 2 / S 3 Q B - ladningsrekombinasjon i NaCl-vasket ( svart linje ), pN15-rekonstituert ( rød linje ) og pN15-AA 1 -rekonstituert ( grå linje ) PSII-membraner. ( B ) S2 / S1 FTIR differensspektraene av NaCl-vasket ( svart linje ) og pN15- eller pN15-AA1-rekonstituert ( rød linje ) PSII membraner. PSII-membraner ble rekonstituert med pN15 ved et molar pN15: PSII-forhold på 50: 1 (1), 100: 1 (2) og 200: 1 (3) og med pN15-AA1 ved 200: 1 (4).

Full størrelse bilde

Den inhibitoriske effekten av pN15 på den oksygenutviklende mekanisme ble ytterligere undersøkt ved FTIR-analyse. FTIR differensspektroskopi er i stand til å oppdage subtile strukturelle endringer koblet til oksygenutvikling, inkludert konformasjonsendringer i polypeptidunderenhetens hovedkjeder, aminosyre sidekjeder, kjernestrukturen i Mn 4 CaO 5- klyngen og substrat og funksjonelle vannmolekyler 42 . S 2 / S 1 FTIR differensspekterene av NaCl-vasket og pN15-rekonstituert PSII-membran er vist i figur 5B. Fremtredende bånd ved 1700-1600 og 1450-1300 cm -1 oppstår hovedsakelig fra amid I-vibrasjoner (C = O strekker av ryggradsmidder) av polypeptid-hovedkjeder og de symmetriske COO - strekkvibrasjoner av omgivende karboksylatgrupper, mens bånd i 1600-1500 cm -1 oppstår enten fra amid II-vibrasjonene (NH-bøyninger kombinert med CN-strekkene av ryggradsmidene) eller de asymmetriske COO - vibrasjoner. Det ble tidligere vist at egenskaper i amid-regionen ble forstyrret ved vasking med NaCl, men gjenopprettet ved PsbP-binding 20 . Imidlertid gjenoppretting av pN15 til NaCl-vasket PSII-membraner ikke gjenvinning av amidbåndene; Tvert imot minske det hele spektralforandringer i 1800-1200 cm -1- regionen og spektralintensiteten var hovedsakelig tapt da rekonstituering ble utført med et molforhold på 200: 1 (pN15: PSII). I motsetning til dette viste tilsetning av pN15-AA 1 med et forhold på 200: 1 en moderat inhibitorisk effekt. Disse dataene angir igjen at S1 til S2-overgangen ble sterkt hemmet av pN15. Det skal bemerkes at forskjeller i omfanget av inhibering blant de forskjellige analysene kan skyldes en lavbindingsaffinitet av pN15 med PSII: Rekonstituerte PSII-membraner ble anvendt uten fortynning i TL-analyse, og de ble ytterligere konsentrert som en hydratisert film anvendt i FTIR, mens prøver nødvendigvis fortynnes i målingene av oksygenutviklende aktivitet. Samlet sett konkluderes det med at pN15 reversibelt hemmer S1 til S2-overgangen til OEC i PSII.

Diskusjon

Det erkjent at PsbP induserer konformasjonsendring rundt OEC slik at Ca 2+ og Cl - ioner kan binde med høy affinitet 20 . I vår studie ble en klar reguleringsmekanisme via det N-terminale domenet til PsbP utlyst, gitt at rekonstitueringen av PsbP, så vel som pN15, påvirker redokspotensialet til Cyt b 559 : både konvertere Cyt b 559 i NaCl- vasket PSII-membraner i HP-form, om enn ufullstendig. Faktisk samhandler pN15 med PsbE og påvirker den strukturelle konformasjonen av Cyt b 559 direkte. Interessant, for oksygenutviklende aktivitet, antyder FTIR- og TL-målinger at pN15 reversibelt hemmer S 1 til S 2- overgangen til OEC. For øyeblikket er det ikke vist et direkte forhold mellom de to observasjonene ovenfor. En mulighet er at noen av det oksidative hullet rundt P680 ble overført til HP-formen Cyt b 559, noe som forårsaket en reduksjon i oksygenutvikling under tilstedeværelse av pN15. For intakt PsbP forhindret sin N-terminale sekvens ikke oksygenutvikling fordi den sekundære elektronoverføringsveien via Cyt b 559 ikke klarer å konkurrere med elektrondonasjonen fra Mn 4 CaO 5- klyngen i intakt PSII 6 . Vi foreslår derfor at PsbP har en dobbel funksjon for å aktivere primær elektronoverføring fra Mn 4 CaO 5- klyngen og også for å sikre sekundær elektronoverføring til P680 • + . Dette ville tillate en fin balanse mellom donor- og akseptorreaksjonene i PSII for å bli utført. Våre resultater kan også være relevante for tidligere observasjoner som viser at eventuell fjerning av PsbP og PsbQ påvirker elektronoverføringen på den reduserende siden av PSII 43, 44 .

Strukturelle forskjeller mellom forskjellige redoksformer av Cyt b 559 er ukjente. En omdannelse fra HP til LP eller IP, former for Cyt b 559, er observert under forskjellige forhold, inkludert salt- og Tris-vasking av PSII-membraner, mens omdannelsen til HP Cyt b 559 har vist seg å være vanskeligere å oppnå eksperimentelt 6 . Det er foreslått at forskjeller i redokspotensial skyldes proteinmiljøet rundt hagen 7 . Vi kunne ikke identifisere noen tverrbindingssteder mellom PsbE og PsbF, men et mulig tverrbindingssted kan bli funnet på stromalsiden, hvor PsbF-antistoffet også kjente sin epitop (figur S4). I den cyanobakterielle PSII-strukturen ligger Glu 6 av PsbE og Arg 18 av PsbF, begge sterkt konserverte fra cyanobakterier til høyere planter, nært nær haem og dets aksiale His-ligander (Fig. S5). Faktisk rapporteres mutasjoner av restene på den cytoplasmatiske siden av Cyt b 559 for å påvirke redoksegenskapene til Cyt b 559 45 . Det er derfor sannsynlig at samspillet mellom pN15 og PsbE på den lumenale siden ville forandre samspillet mellom PsbE og PsbF i deres stromal-vendende regioner, og dermed transformere redoksegenskapene til Cyt b 559 .

Det har blitt foreslått at PsbP har en "katalytisk" funksjon, i tillegg til dens strukturelle rolle som en OEC-underenhet som beskytter Mn 4 CaO 5- klyngen under samlingen av PSII 15, 16 . Faktisk, eliminerer fullstendig eliminering av PsbP i en Arabidopsis- mutant fotot autotrofi som forårsaker en frøplante-dødelig fenotype, mens en minimal mengde PsbP muliggjør fotoautotrofisk vekst og etterfølgende akkumulering av PSII-reaksjonssenteret 21, 22, 23, 24 . I høyere planter forekommer de novo biogenesen av PSII, så vel som reparasjonen av fotoskadet PSII, i stroma-eksponerte thylakoidmembraner, mens PSII-superkomplekset akkumuleres i de stablede granalområder 46 . Det ble observert at LP-formen av Cyt b 559 er for det meste tilstede i stromalmembranene, mens HP-formen er anriket i grana 47 . PsbP lokaliseres hovedsakelig til granaen, men en betydelig mengde PsbP er tilstede i fri form, eller løst forbundet med thylakoidmembranene 48, 49 . Således er det sannsynlig at PsbP har en rolle i finjusterende intern elektronisk overføring i PSII for å redusere levetiden til P680 • + under samlingen av OEC, og beskytte den mot overskudd av energi.

I cyanobakterier foreslås en PsbP homolog, CyanoP, å fungere som en samlingsfaktor for PSII 50, 51, men den nøyaktige funksjonen er fortsatt uklar 52 . På grunn av at CyanoP ikke har en N-terminal forlengelsessekvens, er det sannsynlig at andre proteiner kan ha en slik funksjon, som vår observasjon med PsbP, i cyanobakterier. En nylig studie foreslo at Psb30, fraværende i grønne planter, interagerer med PsbF på den lumenale siden av thylakoidmembranen og påvirker redoksegenskapene til Cyt b 559 i Synechococcus elongatus; Dette vil tyde på at samspillet på den lumenale siden kan påvirke haemets egenskaper innenfor Cyt b 559, et heme som er plassert på stromalsiden 53 . Det er også mulig at PsbV, som også har en interaksjon med PsbE på en måte som ligner PsbP i den cyanobakteriske krystallstrukturen, kan ha en rolle å regulere den interne elektronoverføring i PSII. Videre studier er absolutt nødvendige for å belyse hvordan den forskjellige sammensetningen og ekspresjonen av ekstrinsiske proteiner blant foto-oxygeniske organismer bidrar til å regulere og tune effektiviteten av den interne elektronoverføring av PSII.

Materialer og metoder

Fremstilling av peptidfragmenter

Peptidfragmenter ble produsert av Japan Bio Services (Saitama, Japan). C-terminalen av hvert peptidfragment ble amidert og renhet ble bekreftet å være 95 ~ 97% ved høyytelsesvæskekromatografi (HPLC). Hvert peptidpulver ble oppløst i en MES-buffer (25 mM MES-NaOH, pH 6, 5) før bruk.

Plasmidkonstruksjon, rekombinant proteinuttrykk og rensing

De rekombinante PsbP-WT- og -9-proteiner fra Spinacia oleracea (GenBank Accession Number, CAA29055.1) ble uttrykt i Escherichia coli- stammen BL21 (DE3) og renset som beskrevet tidligere 10, 54 . Tilstedeværelsen av den ønskede mutasjonen i det rekombinante protein ble bekreftet ved anvendelse av MALDI-TOF massespektrometri (Autoflex III; Bruker Daltonics, MA).

Rekonstitusjonsforsøk

Rekonstituering av pN15-peptidfragmentene og PsbP-proteiner til NaCl-vasket PSII-membraner ble utført basert på en tidligere rapportert prosedyre med noen modifikasjon 55 . PSII-membraner, isolert fra spinatblader 56, ble behandlet i 30 minutter med bufferen inneholdende 1, 5 M NaCl på is for å fjerne PsbP og PsbQ. Deretter ble pN15 og PsbP rekonstituert med NaCl-vasket PSII under anvendelse av et molekylforhold på 50: 1, 100: 1 eller 200: 1 (pN15: PSII) og 4: 1 (PsbP: PSII). I kontrollen ble MES-buffer, uten noen peptidfragmenter, brukt. Etter inkubering i 1 time på is, ble de rekonstituerte PSII-prøvene overført for å bestemme tilstanden av deres redoksformer av Cyt b 559, oksygenutviklende aktivitet, FTIR-analyse og TL-målinger. Når det ble indikert, ble PSII-prøver vasket en gang før analysen med buffer (25 mM MES-NaOH, pH 6, 5, 5 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0, 4 M sukrose). Den oksygenutviklende aktivitet i hver PSII-membranprøve ble målt i denne samme buffer ved anvendelse av en Clark-type oksygenelektrode (Hansatech, UK) i nærvær av 0, 4 mM 2, 6-diklor- p- benzoquinon (DCBQ) som en elektron akseptor.

Bestemmelse av redoksformene av Cyt b 559

PSII-membraner ble suspendert ved en Chl-konsentrasjon på 75 μg ml -1 i buffer (25 mM MES-NaOH, pH 6, 5, 5 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0, 4 M sukrose) og de forskjellige redoksformer av Cyt b 559 ble bestemt ved en bølgelengde på 559 nm, fra det reduserte minus oksyderte differanseabsorpsjonsspektra mellom 520 og 580 nm, registrert som tidligere beskrevet 34, 35, 57 ved bruk av et spektrofotometer utstyrt med et fotomultiplikatorrør (UV-2600, Shimadzu, Kyoto, Japan). Fullstendig oksidasjon av Cyt b 559 ble oppnådd ved behandling med 2 mM kaliumferrikyanid (midtpunkt redokspotensial E m ~ 430 mV) etterfulgt av dens trinnvise reduksjon. Reduksjonen av HP-form ( Em ~ 400 mV), IP-form ( E m ~ 200 mV) og LP-form ( E m ~ 50 mV) av Cyt b 559 7, 58, 59, 60 ble utført av Tilsetning av 4 mM hydrokinon ( E m ~ 280 mV), 5 mM natriumaskorbat ( E m ~ 60 mV) og 10 mM natriumditionit ( E m ~ 660 mV) på en trinnvis måte. Absorptionsforskjellen ved 559 nm, i forskjellspekter av hydrokinonreduksjon minus ferricyanidoksidert, ascorbatredusert minus hydrokinonredusert og dithionittredukt minus askorbatreduksjon Cyt b 559, muliggjør innholdet i HP, IP og LP form av Cyt b 559, henholdsvis utledes. Baseliner ble satt ved å tegne en rett linje mellom absorpsjonsforskjeller ved 540 og 580 nm.

Cross-linking eksperimenter

Tverrbinding ble utført som beskrevet tidligere 27, 28 . De NaCl-vasket PSII-membranene, i en konsentrasjon på 0, 5 mg Chl ml -1, ble kryssbundet med pN15-peptidfragmenter i buffer (25 mM MES-NaOH, pH 6, 5, 5 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0, 4 M sukrose ) inneholdende 6, 25 mM EDC og 5 mM N- hydroksysulfosuccinimid (sulfo-NHS). Prøver ble inkubert i 2 timer i mørket og reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette ammoniumacetat til en sluttkonsentrasjon på 0, 2 M. De tverrbundne PSII-membranene ble underkastet SDS-PAGE via 18% SDS-polyakrylamidgel, og separerte proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner og immundetektert med spesifikke antistoffer. Kaninantistoffer mot PsbE og PsbF ble kjøpt fra Agrisera AB, Sverige. Kaninantistoff mot PsbO ble gitt av den sene Dr. A. Watanabe fra Tokyo University. Kaninantistoff mot D1 ble fremstilt av forfatterne.

Termoluminescensmålinger

Termoluminescens ble registrert med et apparat produsert av PSI (Brno, Tsjekkia). For målinger ble en disk med filterpapir 5 mm i diameter gjennomvåt med totalt 10 ug Chl for hver PSII-prøve som ble undersøkt. Hver plate ble deretter inkubert i 2 minutter ved 25 ° C i mørke, avkjølt til -20 ° C og opplyst med en kort aktinisk blits (30 μs). Lysutslipp under prøveoppvarming ble registrert fra -20 ° C til 60 ° C ved en oppvarmingshastighet på 1 ° C s -1 .

FTIR analyse

FTIR-målinger ble utført etter at metoden tidligere ble rapportert 20, 61 med noen modifikasjoner. NaCl-vasket PSII-membraner ble suspendert (2, 5 mg Chl ml -1 ) i en buffer inneholdende 4 mM MES-NaOH, 40 mM sukrose, 5 mM CaCl2 og 5 mM NaCl (pH 6, 0). En aliquot av prøven (10 ul) ble blandet med 1 ul 20 mM kaliumferrikyanid og et ønsket volum på 5 mM pN15 (1, 4, 2, 8 og 5, 6 μl for molforholdet henholdsvis 50, 100 og 200 pN15 til PSII) og tørkes lett på en CaF 2 plate (25 × 25 mm) i en oval form (6 × 9 mm) under en N 2 -gasstrøm. Den resulterende prøvefilm ble moderat hydrert ved å forsegle cellen ved å bruke en annen CaF 2- plate og en silikonavstand (0, 5 mm i tykkelse) som omgir 2 μl 40% (volum / volum) glyceroloppløsning uten å berøre prøven. Prøvetemperaturen ble justert til 10 ° C ved å sirkulere kaldt vann i en kobberholder. Lysinducerte S 2 -minus-S 1 differensspekter (S 2 / S 1- spektra) ble registrert ved bruk av et spektrofotometer (VERTEX 80, Bruker Optics) utstyrt med en MCT-detektor (InfraRed D313-L) ved 4 cm -1 oppløsning 20, 61). Et Ge-filter for å kutte IR-lys ved> 2200 cm -1 (Andover, 4.50ILP-25) ble plassert i IR-banen foran prøven for å forbedre signal-støyforholdene til spektraene samt å blokkere en He -Ne laserstråle fra interferometeret. Belysning ble levert av en Q-switched Nd: YAG laser (INDI-40-10; 532 nm, ~ 7 ns full bredde ved halvmaksimal og ~ 7 mJ puls -1 cm -2 på prøveoverflaten; Spectra-Physics, Storbritannia). Enkeltstrålespektra ble registrert med 100 skanninger (~ 50 s akkumulering) før og etter enkelt-flash-belysning for å beregne et differansespekter, og målingene ble gjentatt 20 ganger med et intervall på 25 minutter. I tilfelle av pN15-behandlede prøver, ble målinger med 20 skanninger gjentatt 100 ganger med et intervall på 5 minutter. Denne forskjellen i varigheten av skanninger og mørke intervall skyldes raskere avspenning av S 2- tilstanden i de pN15-behandlede prøvene (t ~ 20-30 s) enn i den NaCl-vasket prøven (t ~ 150 s).

Tilleggsinformasjon

Hvordan å sitere denne artikkelen : Nishimura, T. et al. Den N-terminale sekvensen av det ekstrinsiske PsbP-proteinet modulerer redokspotensialet til Cyt b 559 i fotosystem II. Sci. Rep. 6, 21490; doi: 10, 1038 / srep21490 (2016).

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens