Anonim

Temaer

  • Celledød i nervesystemet
  • Retina

Abstrakt

Retinitis pigmentosa (RP) refererer til en gruppe arvelige retinal degenerasjoner som resulterer i formstang og kegel-fotoreceptor celledød. Stamcelledød på grunn av skadelige genetiske mutasjoner har vist seg å forekomme hovedsakelig gjennom apoptose, mens mekanismene og egenskapene til den sekundære kjeglecelledød ikke er blitt fullstendig klarlagt. Vår tidligere studie viste at kegelcelledød i rd10- mus, en dyremodell av RP, involverer nekrotiske egenskaper og delvis formidles av den reseptorinteraktive proteinkinasen. Imidlertid er relevansen av nekrotisk kjeglecelledød i menneskelige RP-pasienter ukjent. I den foreliggende studien viste vi at døende kegleceller i rd10- mus viste cellisk forstørrelse, sammen med nekrotiske forandringer som cellisk hevelse og mitokondriell ruptur. I menneskelige øyne viste levende bildebehandling av kjegleceller ved adaptiv optisk skanning av laser-oftalmokopi signifikant økte prosentandeler av forstørrede kegleceller i RP-pasientene sammenlignet med kontrollpersonene. Glasrøret fra RP-pasientene inneholdt betydelig høyere nivåer av gruppe med høy mobilitetsgruppe-boks 1, som frigjøres ekstracellulært i forbindelse med nekrotisk celledød. Disse funnene antyder at nekrotisk utvidelse av kegleceller er involvert i keglegenerasjon, og at nekrose kan være et nytt mål for å forhindre eller forsinke tapet av kegemediert sentralt syn i RP.

Introduksjon

Retinitis pigmentosa (RP), en viktig årsak til arvelig blindhet, er en heterogen gruppe av arvelige retinal degenerasjoner som skyldes stang- og keglefotoreceptorcelledød. Visjonstap i RP begynner vanligvis med nattblindhet på grunn av stavcelledysfunksjon og død, etterfulgt av tap av perifer og sentralvisjon på grunn av keglecelledød. 1 Genetiske studier har identifisert mutasjoner i mer enn 50 gener - mest uttrykt utelukkende i stavceller - som er assosiert med RP. 2, 3 Selv om det forventes at stavceller dør hvis de har de skadelige mutasjonene, er det fortsatt uklart hvorfor kegleceller også dør i RP. Ettersom tapet av kegleformet sentralt og perifert syn er det mest ødeleggende aspektet av RP, vil en bedre forståelse av mekanismer med kegelcelledød være avgjørende for å utvikle nye terapeutiske midler for denne nåværende uhelbredelige sykdommen.

Apoptose og nekrose er to hovedformer av celledød, definert av deres morfologiske utseende. 4 Apoptose er ledsaget av reduksjon av cellevolum og kromatinkondensasjon, og nekrose er forbundet med cellulær og organisk hevelse og plasmamembranbrudd. Apoptose er en aktiv prosess av celledød, formidlet i stor grad gjennom caspase-familien til cysteinproteaser. Selv om nekrose var antatt å være en uregulert form for celledød, er det nå kjent å ha regulerte komponenter, som for eksempel de som involverer receptor-interaktiv protein (RIP) kinaser. 5, 6

I dyremodeller av RP har stavcelledød vist seg å forekomme hovedsakelig gjennom apoptose. 7, 8 Kegelcelledødens modus er mindre karakterisert. Resultatene av vår og andres tidligere undersøkelse av musemodeller av RP viste at kegelcelledød er assosiert med nekrotiske funksjoner som cytoplasmatisk og mitokondriell hevelse og membranbrudd, og den nekrotiske kjeglecelledød ble vesentlig undertrykt av den genetiske eller farmakologiske inhiberingen av RIP kinaser. 9, 10 Disse funnene indikerte at nekrotisk vei er involvert i kegelcelledød i RP, i hvert fall delvis, og kan være et nytt terapeutisk mål. Imidlertid er relevansen av disse funnene i humanpatologi fortsatt ukjent.

Adaptiv optikk (AO) oftalmokopi, inkludert AO-skanning laser oftalmokopi (AO-SLO), tillater ikke-invasiv observasjon av individuelle kegleceller i levende øyne. 11 Med AO-SLO ble keglens tetthet i makula vist å bli redusert og korrelert med visuell funksjon og fotoreceptorlagtykkelse hos RP-pasienter. 12, 13, 14, 15 I den foreliggende studien undersøkte vi muligens involvering av nekrotisk kjeglecelledød hos RP-pasienter ved å undersøke endringer av kegelcellestørrelse ved hjelp av AO-SLO, og vurdere vitreøse nivåer av nekrose-relaterte proteiner .

resultater

Forstørrelse av kjeglecellestørrelse i musemodellen til RP følger sin nekrose-medierte celledød

Rd10- mus er en dyremodell av RP forårsaket av en missense-mutasjon i Pde6β- genet. 16 Mutasjoner i dette genet er funnet hos pasienter med autosomal recessiv RP. 17 Rd10- mus utvikler progressiv stavdegenerasjon som begynner rundt postnatal dag 18 (P18), og bare en liten andel stangceller forblir ved P28; Antallet av kegleceller minker etter hvert etter hvert. Ved bruk av biokjemiske og genetiske teknikker har vi tidligere vist at kjeglecelledød oppstår via RIP-kinase-mediert nekrose. 9 For å undersøke endringer i konefotoreceptorcelletetthet, morfologi og størrelse, utførte vi immunfluorescens med full montering for peanøtagglutinin-lektin (PNA), som selektivt binder seg til konusens indre og ytre segment. Kegelcelletettheten i rd10- mus var sammenlignbare med det hos vildtype-mus (WT) hos P21, mens det ble signifikant redusert ved P42 i rd10- musene (figurene la og b; P <0, 05). Vi undersøkte nå endringene i cellestørrelse under kondegenerasjon. Bredden av det indre segmentet av kjegleceller ble signifikant økt i P21 rd10- musene, og videre forstørret som tap av kegler fremskredet ved dag p42 (figurene la og c; P <0, 01). Disse funnene antyder at utvidelsen av kegleceller oppstår i en tidlig fase av keglegenerasjon hos rd10- mus og er konsistent med den nekrotiske mekanismen for cellefeil .

Utvidelse av kjeglecellestørrelsen i musemodellen av retinitis pigmentosa. ( a ) Helmontert farging av vildtype (WT, venstre panel) og rd10-musliner på P21 (midtpanel) og P42 (høyre panel) med PNA. De nedre panelene er høyere forstørrelse av peanøttagglutinin-lektin (PNA) -positive konusceller. Gul linje: bredden på det indre segmentet av hver kjeglecelle. Skalbjelke, 50 μm (øvre panel), 10 μm (nedre panel). ( b, c ) Kvantifisering av tetthet ( b ) og bredde ( c ) av PNA-positive kegleceller i WT-mus ( n = 6), rd10- mus ved P21 ( n = 6) og rd10- mus ved P42 ( n = 6). * P <0, 05, ** P <0, 01.

Full størrelse bilde

For ytterligere å karakterisere den observerte utvidelsen av kegleceller i rd10- mus, utførte vi neste transmisjonelektronmikroskopi (TEM) analyse. Som vi observerte i en annen studie, viste keglecellene i p42 rd10- musene hevelse av cytoplasma og forstyrrelse av mitokondriell cristae-strukturen (figur 2d). De indre segmentene av konuscellene til rd10- musene ble vesentlig oppsvulmet, ledsaget av vakuoleringen av cytoplasma, plasmamembranavbrytelse og mitokondriell ruptur, som er karakteristikaene for nekrose (figurene 2e og f). Disse funnene demonstrerer at nekrotisk celleforstørrelse oppstår under kondegenerasjon hos rd10- mus.

Nekrotiske endringer av kjegleceller i musemodellen av retinitis pigmentosa. ( a - f ) Representative transmisjonselektronmikroskopibilder av kegelfotoreceptorcellene i villtype (WT; a - c, n = 4) og rd10 mus ( e - f, n = 4) ved P42. Keglecellene i WT-musene inneholdt mitokondrier med veldefinert lamellar cristae (pil, a og c ) og cytoplasma med medium elektrondensitet ( a-c ). Keglecellene i rd10- musene viste svelling og vakuolering av cytoplasma og forstyrrelse av mitokondriale cristae (pil, d ). De hovne indre segmentene av rd10- mus (asterisk, e ) var assosiert med plasmamembranbrudd (pilespiss, f ) og mitokondriell forstyrrelse (pil, f ) n, kjernen; pil, mitokondrier; pilespiss, forstyrrelse av plasmamembranen; asterisk, det indre segmentet av kjegleceller. Skalestang, 2 μm ( a - d, f ), 5 μm ( e ).

Full størrelse bilde

AO-SLO-bildebehandling viser forstørret kjeglecellestørrelse i RP-pasientene

Vi analyserte neste gang kjeglecellestørrelsen hos humane RP-pasienter ved hjelp av AO-SLO-bilder. Som vist i tabell 1 var det ingen signifikante forskjeller i alder, kjønnsfordeling eller aksial lengde av øyet mellom de 10 RP-pasientene og de 7 sunne kontrollene. Kegmosaikkbildene ble oppnådd i retinalområdene ved 1, 0 mm fra fovealsenteret, og diameteren til hvert lyspunkt ble beregnet. Figur 3 viser de representative kegmosaikkbildene og plottene av punktdiameteren i et kontrollfelt og RP-pasienter med variabel sykdomssvikt (Tabell 2, Supplerende Figurer S1). Lyspunktdiametrene i kontrollfagene var hovedsakelig innenfor området 3, 5-5, 0 μm, og flekkene med ⩾ 6, 0 μm diameter ble sjelden observert (figur 3b). I motsetning til dette viste RP-pasientene reduserte prosenter av lyspunkter innenfor 3, 5-5, 0 μm, og de hadde en liten, men betydelig populasjon av store flekker med ⩾ 6, 0 μm diametre (figurene 3d, f og h). Forstørrelsen av lyse flekker ble observert i et tilfelle med en intakt ellipsoid-sone (EZ, Figur 3d, Supplemental Figur S1), samt i tilfeller med unormal (diskontinuerlig) EZ (Figur 3f, Supplerende Figur S2) og fraværende EZ (Figur 3h, Supplerende figur S3) på området undersøkt av AO-SLO.

Full størrelse bord

Kønnestørrelsesanalyse hos mennesker med retinitt pigmentosa. ( a - h ) Avanserte adaptive optiske skanning laser oftalmokopi (AO-SLO) bilder ( a, c, e, g ) og punktdiameteranalysen ( b, d, f, h ) av netthinnen på 1, 0 mm fra foveal senter hos pasienter med kontrollfare ( a, b ) og retinitis pigmentosa (RP) med variabel sykdomssvikt ( c-h ) RP-pasientene viste en redusert andel lyse flekker innenfor 3, 5-5, 0 μm, og en økt andel store steder med ⩾ 6, 0 μm diameter. Forstørrelsen av lyse flekker ble observert i et tilfelle med en intakt ellipsoid-sone (EZ) ( d ), samt i tilfeller med unormalt EZ ( f ) og fraværende EZ ( h ) ved 1, 0 mm eksentrisitet fra fovea. ( i ) Kvantifisering av prosentandelen lyse flekker med ⩾ 6, 0 μm diameter i kontrollpersonene ( n = 7) og RP-pasienter ( n = 10). RP-pasientene hadde betydelig høyere prosenter av forstørrede lyse flekker sammenlignet med kontrollene (5, 3 ± 2, 5 versus 0, 6 ± 0, 6%) * P = 0, 0004.

Full størrelse bilde

Full størrelse bord

Den kvantitative analysen bekreftet at RP-pasientene hadde signifikant høyere prosentandeler av forstørrede lyspunkter med ⩾ 6, 0 μm sammenlignet med kontrollpersonene (5, 3 ± 2, 5 versus 0, 6 ± 0, 6%, P = 0, 0004, Figur 3i). Selv om RP-pasientene med fraværende eller abnorm (diskontinuerlig) EZ hadde relativt høyere prosenter av forstørrede lyse flekker (6, 7 ± 2, 3%), viste to RP-pasienter med intakt EZ fortsatt en økt andel forstørrede lyse flekker (5, 7% i tilfelle 3 og 3, 0% i tilfelle 8, tabell 2, tilleggs figur S4). Bare en RP pasient viste en normal fordeling av punktstørrelse (tilfelle 9).

Økte HMGB1 nivåer i glassrørene hos RP-pasientene

Gruppeboks med høy mobilitet (HMGB1) er et intracellulært DNA-bindende protein som regulerer transkripsjonsaktivitet; Det frigjøres imidlertid til det ekstracellulære rommet under stressede forhold som forårsaker nekrose, og det medierer inflammatoriske signaler. 19, 20, 21 For å undersøke involveringen av nekrotisk celledød i RP, undersøkte vi endringene av HMGB1-frigivelse i glaskroppen hos RP-pasientene. Basisegenskapene til RP og kontrollpatienter ble vist i tabell 3. HMGB1-nivåene var signifikant høyere hos 10 pasienter med RP (2, 4 ± 1, 9 ng / ml) sammenlignet med 10 pasienter i vår kontroll (0, 7 ± 1, 0 ng / ml, P = 0, 0312; figur 4).

Full størrelse bord

Økt nivå av gruppe med høy mobilitet gruppe-1 i glasset av pasienter med retinitt pigmentosa. Proteinnivåer av frigjort gruppe med høy mobilitetskombinasjon-1 (HMGB1) i glassplaten av kontrollpatienter med epiretinalmembran (ERM; n = 10) og pasienter med ERM sekundær til retinitt pigmentosa ( n = 10). * P = 0, 0312.

Full størrelse bilde

Diskusjon

I den foreliggende studien demonstrerte vi at kegselceller i rd10- mus viser mobil forstørrelse under kuledegenerasjon, og er forbundet med nekrotiske egenskaper som cytoplasmatisk og organisk hevelse og membranbrudd. Involveringen av nekrose i cone celledød rapporteres også hos mus som mangler interphotoreceptor retinoidbindende protein (Irbp), en annen RP-modell. 10 Ved bruk av AO-SLO viste vår studie at et betydelig antall kjegleceller viser forstørrede spotstørrelser i makuleringen av RP-pasienter. I tillegg ble glassplatenivåene av HMGB1 økt hos RP-pasienter. Sammen med resultatene fra eksperimentelle studier, kan disse funnene foreslå involvering av nekrotisk kjeglecelledød i patologi av humant RP. I overensstemmelse med denne ideen viste tidligere histologiske studier av postmortem-RP-pasientene de nekrotiske endringene av kjegleceller som hovent cytoplasma og forstyrret plasmamembran. 22

Selv om den nyeste generasjonen av AO-oftalmokopi er i stand til å løse både stang- og kegfotoreceptorceller, tillot 23, 24 resolusjonsgrensene for vårt konfokale AO-SLO-system ikke tillatelse til visualisering av staveceller på grunn av deres småcellestørrelse. I denne studien viste vi at de lyse flekkene i AO-SLO-bildebehandling, hvor signalet er kjent for å utlede i stor grad fra konusens ytre segmenter, var 25 på 3, 5-5, 0 μm i diameter ved 1, 0 mm eksentrisitet fra fovea i kontroll fag. Disse spotstørrelsene ser ut til å være mindre enn diameteren av kegles indre segmenter med samme eksentrisitet i de postmortemmenneske øynene (6, 0-7, 5 μm). 26 Dette kan skyldes forskjellene i cellekammeret visualisert ved hver metode. Disse funnene er konsistente med en nylig studie som viser at kegles indre segmentstruktur oppnådd av ikke-konfokalsplittetektor AO-SLO er større enn tilsvarende lyspunkt i konfokale AO-SLO-bilder. 27

Tidligere AO-bildeundersøkelser av RP-pasientøyner har vist at keglens lyse flekker blir uklare eller fraværende i områder med alvorlig retinal degenerasjon, sannsynligvis på grunn av tap av kegleceller eller forstyrrelse av den ytre segmentstrukturen. Fordi uskarphet av kjegemosaikkbilde kan føre til feil måling av spotstørrelsen, oppnådde vi AO-SLO-bilder fra RP-pasienter som beholdt god synsstyrke. Vår studie viste at de lyse flekkstørrelsene i RP-pasientene i stor grad var sammenlignbare med kontrollene, noe som tyder på at kvaliteten på keglebilder kan være hensiktsmessig for analysen. I tillegg fant vi en liten, men signifikant populasjon av kjegleceller med økte spotstørrelser hos RP-pasienter. Utvidelsen av keglebilde ble observert selv hos pasienter med intakt EZ, noe som tyder på at disse funnene kan reflektere de tidlige morfologiske endringene av kegleceller under kegdegenerasjon i RP. Spørsmålet om hvorvidt de utvidede lyse flekkene endelig vil gå tapt og bli mørke områder i AO-SLO, garanterer videre langsgående undersøkelser.

Intracellulær innhold frigjort fra døende eller døde celler virker som skadeassosierte molekylære mønstre (DAMP) for å fremme inflammatorisk respons og vevskader. 28 HMGB1 er en av de best karakteriserte DAMPene utgitt fra nekrotiske celler. 19, 20 I glassglasset hos pasienter med retinal detachment, som ikke bare omfatter apoptotisk celledød, men også nekrotisk fotoreceptorcelledød, økes nivåene av ekstracellulær HMGB1 og korrelerer med kjemokinnivåer. 29 I samsvar med disse funnene observerte vi at HMGB1-nivåene i RP-pasientene i glasset var signifikant forhøyet sammenlignet med de i de ikke-degenerative kontrollene, og støttet ideen om at nekrotisk celledød er involvert i den degenerative prosessen med RP. Vi har nylig observert at glasrør av RP-pasienter inneholder betydelige mengder inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, og at intraokulær betennelse målt ved slitlampe eller laserfargemeter er omvendt forbundet med sentral visuell funksjon. 30, 31 Selv om forholdet mellom celledød og betennelse må undersøkes nærmere, kan DAMPs frigjort fra nekrotiske celler øke betennelse og retinal degenerasjon i RP.

Selv om den eksakte cellekilden til HMGB1 i RP pasientøyne forblir ukjent, antyder de histologiske funnene av dyremodeller og humane pasienter med RP at nekrotiske kjegleceller kan være en viktig kilde til HMGB1. Det har vist seg at stavcelledød forårsaket av genetiske mutasjoner forekommer hovedsakelig gjennom apoptose i flere modeller av RP. 7, 8 Sammenlignet med disse funnene viste vår tidligere studie at RIP kinaseinhibering undertrykker nekrotisk kjegle, men ikke apoptotisk stavcelledød i rd10- mus. 9 I motsetning til dette, Sato et al. 10 nylig rapporterte at stavcelledød delvis er mediert av RIP- kinaseavhengig bane i Irbp-deficiente mus. Selv om mutasjonene i IRBP er sjeldne hos RP-pasienter, 32, antyder disse funnene at nekrotisk stavcelledød kan eksistere i en delmengde av RP. Imidlertid, fordi RP-pasientene som gjennomgikk vitrektomi i studien vår, var i et relativt avansert stadium av sykdommen forbundet med alvorlig stavdegenerasjon, er det lite sannsynlig at det forblir store mengder stav-avledede DAMP i glassene av disse pasientene.

En begrensning av vår studie er mangelen på informasjon om de genetiske bakgrunnene til RP-pasientene. Imidlertid antyder variabel arvsmodus og klinisk kurs blant pasientene at utvidelsen av kjegleceller kan være forbundet med den heterogene tilstanden til RP. En annen begrensning er de forskjellige pasientbakgrunnene mellom pasienter involvert i AO-SLO-studien og pasienter analysert for glasslegemet HMGB1. Fordi det er begrenset mulighet til å skaffe seg glassprøver fra pasienter i tidlige stadier av RP, kunne vi ikke adressere de tidligere HMGB1-endringene i glassrørene hos RP-pasienter. Likevel, sammen med resultatene fra eksperimentelle studier 9, antyder disse funnene at nekrotisk celledød kan være involvert i ulike faser av keglegenerasjon i RP. Ytterligere studier for å undersøke forholdene mellom gener, sykdomskurs og kegselcelleendringer vil være viktige for å tydeliggjøre kjeglecellemekanismer i RP.

Som konklusjon viste resultatene av den foreliggende studien at i en musemodell av RP viser døende kegselceller nekrotisk morfologi som cellulær og organisk hevelse og ruptur. Forstørrelsen av kjegleceller ble også observert i makuleringen av RP-pasienter i vår AO-SLO-analyse, og den ekstracellulære frigjøringen av HMGB1, en nekrose-relatert DAMP, ble økt i glasrøret hos RP-pasientene. Samlet sett indikerer disse funnene at nekrotisk kjeglecelledød kan ligge under patogenesen til RP, og foreslå nekrose-relaterte molekylveier som nye mål for å forhindre eller forsinke tapet av konformidert sentrisyn i RP.

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Supplerende tall

Word-dokumenter

  1. 1.

    Supplerende Figur Legends

Anbefalt Redaksjonens