Anonim

Temaer

  • Mesenkymale stamceller
  • Stamcelleterapier

Abstrakt

Postnatalt forekommer arr som følge av kutan sårheling. Scarless sårheling er svært ønsket for pasienter som har gjennomgått kirurgi eller traumer, spesielt til utsatte områder. Basert på egenskapene til mesenkymale stamceller (MSCs) for vevreparasjon og immunmodulering, undersøkte vi potensialet for MSCs for scarless sårheling. MSC ble utvidet fra navlestrengsblod (UCB-MSCs) og Wharton's gelé (WJ-MSCs) fra sunne givere som gjennomgikk valgfrie fullfristede graviditets keisersnitt. UCB-MSCs uttrykte lavere nivåer av de preinflammatoriske cytokinene IL1A og IL1B, men høyere nivåer av de ekstracellulære matriksen (ECM) -degradasjonsenzymer MMP1 og PLAU sammenlignet med WJ-MSCs, noe som tyder på at UCB-MSCs var mer sannsynlig å favorisere scarless sår helbredelse. Imidlertid klarte vi ikke å finne betydelige fordeler for stamcellebehandling for å forbedre sårheling og redusere kollagenavsetning etter direkte injeksjon av 1, 0 × 10 5 UCB-MSC og WJ-MSCs i 5 mm fulle sider med hudtykkelse i nakne mus. Interessant nok pleide implantasjonen av UCB-MSC å øke ekspresjonen av MMP2 og PLAU, to proteaser involvert i nedbrytning av den ekstracellulære matriksen i sårvevet . Basert på våre data, er UCB-MSCs mer sannsynlig å være en gunstig potensiell stamcellekilde for scarless sårheling, selv om en bedre eksperimentell modell er nødvendig for bekreftelse.

Introduksjon

Sårreparasjon i huden utføres via komplekse prosesser 1 . Postnatalt resulterer sårreparasjon hos pattedyr vanligvis i en ikke-funksjonell masse av fibrotisk vev kjent som et arr 1 . Avskåret fra normal hud, er arvevev preget av mangel på epidermale vedlegg, endringer i strukturen av epidermis basalcellelag, og endringer i ekstracellulær matriks (ECM) struktur og komponenter 2 . Den forskjellige farge og tekstur av arrvæv i eksponerte områder som ansikt eller hender kan også redusere livskvaliteten. Noen anti-arrdannelser, inkludert fysisk avspenning av spenning i sårmarginene og administrasjon av tranilast eller rekombinant human transformerende vekstfaktor p3, har blitt klinisk testet 3, 4, men viste begrensede marginale effekter. Derfor er scarless sårheling svært ønskelig for pasienter som har hatt kirurgi eller traumer, spesielt til utsatte områder.

Selv om mekanismene ikke er fullstendig forstått, antas året sårheling å være forbundet med immunresponsen, spesielt vedvarende inflammatoriske responser 5 . Den raske fremgangen i stamcelleundersøkelser har tydelig vist at mesenkymale stamceller (MSCs) representerer lovende stamcellekilder for reparasjon / regenerering av skadede vev / organer. Utover deres søknad om reparasjon av skadet vev, har MSC også blitt brukt til behandling av autoimmune sykdommer og GVHD (graft versus host sykdom) på grunn av deres immunoregulerende egenskaper 6 . Til dato har mange kliniske studier vist at MSC kan fremme helbredelsen av forskjellige sår, inkludert kroniske hudsår forårsaket av diabetes mellitus, strålingseksponering og iskemi 7, 8 . Nylig ble det også rapportert fordelene med MSC i en kanin-ørehypertrofisk arrmodell 9 . Med tanke på immunregulerende egenskaper hos MSC, er det ganske mulig at MSCs favoriserer scarless sårheling.

I denne studien undersøkte vi potensialet for MSCer fra navlestrengsblod (UCB-MSC) og Wharton's Jelly (WJ-MSC), de mest brukte mesenkymale stamceller fra foster 10, for scarless sårheling. Videre forsøkte vi å belyse de relevante mekanismene på stamcellebasert terapi for scarless sårheling.

resultater

Cellvekst, morfologiske egenskaper og fenotypisk karakterisering av UCB-MSCs og WJ-MSCs

Vi utvidet et tilstrekkelig antall WJ-MSCer fra 8 av 9 Warton's geléprøver innen 4 uker; Imidlertid klarte ikke en prøve å vokse celler på grunn av en teknisk feil (tilleggstabell 2). Derimot utvidet kun 2 av de 13 UCB-prøvene til over en million MSCs innen 6 uker (Tilleggstabell 2). For å redusere individuell variasjon på grunn av forskjeller i genetiske og ikke-genetiske bakgrunner, brukte vi UCB-MSCs og WJ-MSCs utvidet fra den samme giveren for følgende eksperimenter.

Selv om både UCB-MSCene og WJ-MSCene vedtok fibroblastlignende spindelformer, var UCB-MSCene mindre i størrelse og inneholdt høyere kjernefysisk svingning (figur 1a). UCB-MSCene vokste også mye raskere enn WJ-MSCs (figur 1b).

( a ) Representative bilder av UCB-MSCs og WJ-MSCs fra første passasje celler som demonstrerer den fibroblastlignende spindelformen etter 3 og 5 dager i kultur. UCB-MSCene ble vist å være mindre i størrelse og viste høyere atomfluktuasjon (40 ×, skalaer 200 μm). ( b ) Celleveksten av UCB-MSCs var betydelig raskere enn WJ-MSCs. ( c ) Flowcytometrianalyseekspresjonsprofiler av celleoverflate markørene CD34, CD44, CD45, CD73, CD90 og CD105 i UCB-MSCs og WJ-MSCs. Et representativt histogram presenteres. De fargede linjene og de fargede områdene representerer uttrykket av henholdsvis UCB-MSC og WJ-MSC. De grå områdene representerer isotype-negativ kontroll.

Full størrelse bilde

Samtykket godt med tidligere studier 11, 12, UCB-MSCs og WJ-MSCs uttrykte de formodede mesenkymmarkører CD44, CD73, CD90 og CD105, men ikke de hematopoietiske markørene CD34 og CD45 (figur 1c). Disse resultatene bekreftet fenotypisk karakterisering av celler som mesenkymale stamceller.

Differensial ekspresjon av gener assosiert med sårheling og fibrose mellom UCB-MSCs og WJ-MSCs

Vi sammenlignet omfattende uttrykket av gener forbundet med sårheling og fibrose i UCB-MSCs og WJ-MSCs ved hjelp av RT 2 Profiler PCR array. Interessant var uttrykksnivåene av noen gener i stor grad forskjellig mellom UCB-MSC og WJ-MSC, selv når cellene ble utvidet fra den samme donoren (figur 2 og tilleggstabell 3). For eksempel er MMP1 og PLAU, som er involvert i nedbrytningen av ECM 13, 14, høyt uttrykt i UCB-MSCs sammenlignet med WJ-MSCs (figur 2a). I motsetning hertil ble uttrykket av COL3A1, et gen kjent for å produsere komponenten av type III kollagen, observert ved mye lavere nivåer i UCB-MSCs enn i WJ-MSCs (figur 2a). Videre uttrykte UCB-MSCs mye lavere nivåer av IL1A og IL1B som koder for den proinflammatoriske cytokininterleukin (IL) -alpha og IL-1beta sammenlignet med WJ-MSCs (figur 2b), men uttrykte høyere nivåer av HGF, en anti- fibrotisk vekstfaktor kjent for å forbedre sårheling (figur 2c).

Vi funksjonelt kategoriserte gener i ECM strukturelle bestanddeler og remodeling enzymer ( a ), inflammatoriske cytokiner og kjemokiner ( b ), vekstfaktorer ( c ), TGF-beta superfamiliemedlemmer ( d ), celleadhesjonsmolekyler ( e ) og transkripsjonsfaktorer og andre fibrosefaktorer ( f ). Dataene presenteres som middel for foldendring av uttrykk i UCB-MSCs sammenlignet med WJ-MSCer fra tre separate eksperimenter.

Full størrelse bilde

Verken UCB-MSC eller WJ-MSC har ikke akselerert sårheling i nakne mus

Vi injiserte UCB-MSCs og WJ-MSCs direkte inn i sårstedene med 5 mm diameter hudfeil i full tykkelse i nakne mus, og registrerte deretter lukningen av sårene over tid. Sårene helbredet godt i alle musene. Makroskopisk ble sårene nesten lukket på 7 dager og opptrådte som arrvev 14 dager etter behandling (figur 3a). Det var ingen åpenbar forskjell i sårets lukningshastighet blant gruppene i løpet av 14 dagers oppfølgingsperiode. Kvantitativ analyse viste at det målte sårområdet var noe mindre hos mus som fikk enten UCB-MSC eller MJ-MSC sammenlignet med musene som fikk kontrollbehandlingen på 1 og 3 dager, men det var ingen signifikant forskjell mellom gruppene (fig. 3b). Vi har også visuelt målt arrområdet (prikkede linjer i bildene på figur 3a) 14 dager etter behandling, men igjen var det ingen signifikant forskjell mellom gruppene (figur 3c).

Sårene til mus ble injisert med mesenkymale stamceller avledet fra humant navlestrengblod (UCB-gruppe) og Warton's Jelly (WJ-gruppe) eller medium alene (Kontrollgruppe), og sårlukking ble registrert makroskopisk etter behandling. ( a ) Representative bilder av brutto utseendet av ekskisjons sår over tid etter behandling. ( b ) Kvantitative data angående andelen sår som er gjenværende åpne i forhold til det første sårområdet ved forskjellige tidspunkter etter behandling. ( c ) Kvantitative data på det visuelle arrområdet 14 dager etter behandling. Det visuelle arrområdet ble omhyggelig sirklet på bilder av sår (mørke prikkede linjer på figur 3a). Prosentandelen av arrområdet ble beregnet i forhold til det opprinnelige sårområdet.

Full størrelse bilde

Fordi disse sårene var nesten stengt innen 7 dager, vurderte vi at sårene var i proliferasjonsfasen fra 3 til 7 dager etter behandling 15 . Derfor høstet vi sårvev for histologisk analyse av reepitelialisering 3 dager etter behandling. Vi kunne lett se de epithelialiserte sårtunnene på to sårsteder fra bildene av HE-fargede seksjoner (figur 4a). Vi målte bredden på såret og lengden på reepitelialiseringen (bredden av såret minus avstanden mellom reepitelialiserte sårtunge); forholdet mellom reepitelialisering ble beregnet ved lengden av reepitelialiseringen / bredden av såret x 100. Det var ingen signifikant forskjell i reepitelialiseringen blant gruppene (figur 4b, c), noe som tyder på at implanteringen av UCB-MSCs og WJ-MSC ikke fremskynde reepitelialisering av hudtykkssår med full tykkelse i nakne mus .

( a ) Representative bilder av sårvev med HE-farging 3 dager etter behandling. De opprinnelige sårmarginene (angitt med piler) og reepithelialiseringskanterne (arrowheads) ble nøye identifisert under mikroskopet. Avstandene mellom to sårmarginer (B; sårlengder) og mellom to reepitelialiseringskanter (A) ble målt. Bildene av hele sårvev ble tatt under en lavmotorisk linse (40 ×, skalaer 200 μm). Innspillets høyeffekt (200 ×) bilder indikerer epitel-tunger (omgitt av de stiplede hvite linjene) av sårene. ( b ) Kvantitative data på avstandene mellom reepitelialiseringskanter 3 dager etter behandling. c ) Forholdet mellom reepitelialisering ble målt ved: [sårlengden (B) minus avstandene mellom reepitelialiseringskantene (A)] / B × 100. ( d ) Representative bilder av sårvev med HE-farging 7 dager etter behandling. Granuleringsområdet var omgitt av de stiplede svarte linjene (40 ×, skalaer: 200 μm). ( e ) Arealet av granulert vev ble målt ved hjelp av Adobe Photoshop CS6 Extended-programvare.

Full størrelse bilde

Vi måler også mengden granulering i sårvevet 7 dager etter behandling ved hjelp av HE-fargede seksjoner (figur 4d). Uventet oppnådde musene som fikk UCB-MSC og WJ-MSC implantatene en økt mengde granulert vev sammenlignet med kontrollgruppen av mus (1, 21 ± 0, 07 i UCB-gruppen og 1, 16 ± 0, 13 i WJ-gruppen versus 1, 00 ± 0, 01 i Kontrollgruppen), selv om det ikke var noen signifikant forskjell mellom gruppene (figur 4e).

Verken UCB-MSC eller WJ-MSC har ikke bidratt til scarless sårheling i nakne mus

Vi avsluttet oppfølgingen 14 dager etter behandling fordi arrene ble ansett å være nesten modnet. Vi observerte ikke regenerering av hudtilskudd i noen av musene ved sluttpunktet for oppfølging (figur 5a). For å evaluere scarless sårheling, målt vi kollagenavsetning ved Masson trichrome-farging (figur 5b). Halvkvantitativ analyse viste at arrvev med åpenbar kollagenavsetning (farget i blått) ikke var vesentlig forskjellig mellom grupper (figur 5c), selv om arrvævet i WJ-MSC-gruppen viste en tykkere, lavere bredde og mindre område sammenlignet med med de to andre gruppene. Vi utførte Picrosirius rød flekker for å oppdage type I og III kollagenfibre (figur 5d). Selv om kvantitativ analyse var vanskelig, ble positiv farging for type I og III kollagenfibre observert å være lik blant gruppene (figur 5d). Disse funnene antydet at UCB-MSC og WJ-MSC ikke bidro signifikant til scarless sårheling i nakne mus.

( a ) Representative bilder av sårvev med HE-farging (40 ×, skalaer 200 μm). ( b ) Representative bilder av sårvev med Massons trichromfarging (40 ×, skalaer 200 μm); arrvevene ble farget blå. ( c ) Kvantitative data på området, bredden og tykkelsen av arr basert på bildene av vevseksjoner med Massons trichromfarging. ( d ) Representative bilder av sårvev med Picrosirius rød farging for analyse av kollagenfibre. De innsatte forstørrelsesbildene i det nedre panelet ble brukt til å oppdage justeringen av type I kollagen (gul) og type III kollagen (grønt) i arret ved hjelp av polarisert lysmikroskopi.

Full størrelse bilde

Implantasjonen av UCB-MSCs og WJ-MSCs i sårene av nakne mus hadde en tendens til å øke kollagensyntese og inflammatorisk cytokinproduksjon

Vi undersøkte også angiogenese, rekruttering av makrofager og uttrykket av flere inflammatoriske cytokiner og vekstfaktorer som er kjent for å være nært forbundet med sårhelingsprosessen i sårvevet 3 og 7 dager etter behandling (figur 6). Resultatene var i samsvar med de histologiske funnene. WJ-MSCs implantasjon hadde en tendens til å øke uttrykket for COL3A1 7 dager etter behandling (p = 0, 078 mot kontrollgruppe, figur 6b). Selv om uttrykket av noen inflammatoriske cytokiner, slik som IL1A og IL1B, ble økt i sårvevet av mus behandlet med UCB-MSCs og WJ-MSCs (figur 6c, d), men ikke signifikant forskjellig blant gruppene. Disse dataene foreslo at xenotransplantasjonen av humane UCB-MSC'er og WJ-MSC'er i sårene av nakne mus kunne forbedre kollagensyntese og den inflammatoriske responsen. Interessant nok økte implantasjonen med UCB-MSC, men ikke WJ-MSC, noen gener forbundet med ECM-remodeling, inkludert MMP2 (p = 0, 019 vs. kontrollgruppe, figur 6j) og PLAU (p = 0, 080 vs. kontrollgruppe, fig. 6k), 3 dager etter behandling. Selv om uttrykket for antiinflammatorisk cytokin IL10 og antifibrotisk faktor, ble HGF også økt ved implantasjonen med UCB-MSCs (figur 6g, h), var det ikke signifikant forskjellig blant gruppene på grunn av kjøpesenterets størrelse og Den store individuelle forskjellen på prøver.

Vevsprøver ble samlet 3 dager (n = 6 i hver gruppe) og 7 dager (n = 6 i kontrollgruppen og n = 7 i UCB-MSC- og WJ-MSC-gruppene) etter behandling. De kvantitative data fra RT-PCR ble normalisert ved ekspresjon av 18S ribosomalt RNA.

Kontrollgruppe,

UCB-MSC-gruppe,

WJ-MSC gruppe. * p <0, 05 vs. Kontrollgruppe. † p <0, 10 vs. Kontrollgruppe.

Full størrelse bilde

Vi observerte ikke åpenbare forskjeller i uttrykket av angiogenesemarkøren CD31 blant gruppene ved IHC-farging eller western blotting-analyse (figur 7a, b). Tilsvarende var det ingen åpenbar forskjell i makrofaginfiltrasjon i sårvevet mellom gruppene (figur 7c, d).

( a ) Representative bilder av immunohistokjemi-farging med endotelmarkøren CD31 (400 x, skalaer 50 μm). Tettheten av mikrofartøy som positivt ble farget for CD31 ble observert å være lik i sårvevet mellom grupper. ( b ) Western immunoblotanalyse av CD31-ekspresjon i sårvev. ( c ) Representative bilder av immunfarging med F4 / 80, en markør for makrofager (400 ×, skalaer 50 μm). ( d ) Western immunoblotanalyse av F4 / 80-ekspresjon.

Full størrelse bilde

Diskusjon

Scarless sårheling er svært ønsket for pasienter som har hatt kirurgi eller traumer, spesielt til utsatte områder. Vi valgte UCB-MSCs og WJ-MSCs som kandidatkilder til stamceller for å teste for scarless sårheling på grunn av følgende årsaker: 1) MSCs med forskjellig opprinnelse har blitt demonstrert for å fremme sårheling og har blitt klinisk brukt til behandling av hudsår 16, 17 ; 2) MSC har immunmodulasjonsegenskaper 12, 18, hvilket indikerer deres potens for anti-fibrotisk / arrdannende terapi; 3) Noen pediatriske pasienter krever en kirurgisk prosedyre på grunn av medfødte sykdommer, og en tilstrekkelig mengde navlestrengsblod og Whartons gelévev oppnås lett uten behov for invasive prosedyrer; og 4) isolering og eks vivo ekspansjon av MSCs fra navlestrengsblod og Wharton's gelé har blitt teknisk oppnådd 10, og disse utvidede UCB-MSCs og WJ-MSCs kunne lagerføres for fremtidige applikasjoner.

Ligner på en tidligere rapport 19, utvidet vi lett et tilstrekkelig antall celler fra Whartons gelé; Dessuten ble disse utvidede cellene karakterisert som MSCs. Selv om vi samlet et tilstrekkelig volum med navlestrengsblod (33-85 ml / donor) og brukte en protokoll som ligner på en tidligere beskrevet metode for å utvide MSCs 12, 18, klarte vi ikke å øke tilstrekkelig mengde MSC fra de fleste donorprøver. Årsaken til denne tekniske feilen er uklar, men en annen studie rapporterte det samme problemet (<10% suksessrate) 12 . Selv om MSC allografter har blitt anvendt klinisk for immunforsvar 6, anses en autograft av stamcellebehandling naturlig for å være et overlegent alternativ for scarless sårheling. Derfor er metodologiske modifikasjoner nødvendig for å forbedre den vellykkede eks vivo ekspansjonshastigheten til UCB-MSCs.

MSCs er kjent for å eksistere som en heterogen befolkning. Nylig ble det rapportert et forsøk på å biologisk karakterisere benmarg-avledede MSCs ved bruk av ulike biofysiske markører 20 . Disse MSCene ble vist å ha en liten størrelse med høy kjernefysisk svingning, og derved forutsi "stivhet" og forbedret terapeutisk kapasitet. Interessant nok var UCB-MSCene i denne studien observert å være mindre i størrelse med høyere atomfluktuasjon sammenlignet med WJ-MSCs. Videre studier er nødvendig for å forstå den biologiske betydningen av de forskjellige morfologiske egenskapene mellom WJ-MSC og UCB-MSC, og også å avgjøre om UCB-MSC har bedre egenskaper for vevregenerering / reparasjon.

De mest interessante funnene i denne studien var differensial uttrykk for gener knyttet til fibrose og sårheling mellom UCB-MSCs og WJ-MSCs. Våre data viste at UCB-MSCs uttrykte høyere nivåer av ECM remodeling enzymer, men lavere nivåer av collagener. Videre uttrykte WJ-MSC høyere nivåer av de proinflammatoriske cytokiner IL-1alpha og IL-1beta 21 . Videre var den anti-fibrotiske sårhelende faktor HGF også svært uttrykt i UCB-MSCs. Disse genuttrykksprofiler tyder sterkt på at UCB-MSCs kan representere en potensiell stamcellekilde for scarless sårheling.

Tidligere studier viste tydelig fordelene med UCB-MSCs og WJ-MSCs for sårheling 16, 17 . Imidlertid klarte vi ikke å bekrefte fordelene med UCB-MSCs og WJ-MSCs i sårheling ved å bruke den veletablerte hudtykkemodellen med full tykkelse i nakne mus ved histologiske analyser. Verken UCB-MSC eller WJ-MSCs favoriserte ikke sårheling i vår eksperimentelle dyremodell. Derimot indikerte våre data at injeksjonen av UCB-MSCs og WJ-MSCs i dermale defektsteder i nakne mus økte ekspresjonen av TGF-beta1 og kollagener i stedet for dempende arrdannelse. Ekspresjonen av IL1A og IL1B, to inflammatoriske cytokiner som er kjent for å stimulere proliferasjonen av hudfibroblaster og fremme deres differensiering i myofibroblaster 22, ble også økt i sårvevet 7 dager etter implantasjon med UCB-MSCs og WJ-MSCs.

Arter er kjent for å danne som et resultat av en sekvens av biologiske responser i sår, slik som angiogenese, betennelse, granulering og ECM remodeling. Derfor kan de negative dataene fra våre in vivo undersøkelser ha flere forklaringer. Den første er spørsmålet om valget av den eksperimentelle dyremodellen. En vedvarende inflammatorisk respons anses å spille sentrale roller i sår sårheling, men vi brukte immunodeficiente nøte mus for eksperimentet. Kutane sår i nakenmus har blitt rapportert å helbrede med mindre arr og lavere nivåer av kollagenavsetning 23 . I denne studien helbredes hudfeilen på 5 mm med høy tykkelse veldig fort og så nesten som vanlig hud innen 14 dager, selv hos musene som fikk kontrollbehandlingen. Derfor, om nakne mus skal brukes til å teste scarless sårheling, er fortsatt et åpent spørsmål.

For det andre er det mulig at antall administrerte celler var for små til å ha en tilstrekkelig terapeutisk effekt. Tidligere studier rapporterte forskjellige resultater når UCB-MSCs og WJ-MSCs ble brukt til sårheling ved direkte injeksjon av> 3, 0 × 10 5 celler i en 5 mm fullstendig tykkelsesfeil 16, 17 ; Derimot injiserte vi bare 1, 0 × 10 5 celler i denne studien. Overlevelsesraten for celler har blitt rapportert å være svært dårlig etter injeksjon i sårstedet 24, og forbedringen av celleretensjon ved bruk av stillaser har blitt vist å øke effekten av stamcellebehandling 25 . Ytterligere eksperimenter som involverer injeksjon av flere celler, er nødvendige for å undersøke den fordelaktige effekten av UCB-MSCs og WJ-MSCs for scarless sårheling.

Til slutt kan de immunomodulerende egenskapene til UCB-MSCs og WJ-MSCs ikke lett observeres i nakne mus på grunn av mangelen på T-celler 23 . Imidlertid ble produksjonen av de inflammatoriske cytokinerne IL-1alpha og IL-1beta forbedret i sårvevet som mottok implantasjonen med UCB-MSCs og WJ-MSCs. Dette resultatet antydet at xenotransplantasjonen av humane MSCer til nakne mus kan også øke immunresponsene, og dermed negere fordelen av UCB-MSCs og WJ-MSCs for scarless sårheling.

Selv om de totale dataene for våre in vivo undersøkelser ble vurdert å være negative, ble noen parametere, som uttrykkene for antifibrotisk vekstfaktor HGF og antiinflammatorisk cytokin IL-10, økt i sårvevet ved 3 eller 7 dager etter implantasjon med UCB-MSCs, men ikke WJ-MSCs. På samme måte forbedret kun implantasjonen med UCB-MSCs ekspresjonen av ECM-nedbrytningsenzymer (dvs. MMP2 og PLAU ) i sårene. Fordi produksjonen av cytokiner og vekstfaktorer har blitt vist å spille kritiske roller i den immunomodulerende egenskapen til MSCs 6, gir disse data indirekte bevis for at UCB-MSCs kan favorisere skarpe sårheling gjennom parakrine mekanismer. Imidlertid er det nødvendig med ytterligere studier for å bekrefte spekulasjonen.

I sammendraget undersøkte vi styrken til UCB-MSCs og WJ-MSCs for scarless sårheling. Gene ekspresjonsprofiler viste at UCB-MSCene uttrykte mye høyere nivåer av MMP1 og PLAU, men lavere nivåer av de inflammatoriske cytokinene av IL1A og IL1B . Selv om vi ikke klarte å demonstrere fordelene med UCB-MSCs og WJ-MSCs for scarless sårheling i en fullverdig hudfeilmodell av nakne mus, økte implanteringen av UCB-MSC ekspresjonen av flere ECM-nedbrytningsenzymer i sårvevet under proliferasjonsfasen. Dermed er UCB-MSCs mer sannsynlig å være en potensiell stamcellekilde som er gunstig for scarless sårheling.

Materialer og metoder

etikk

Denne studien ble godkjent av Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences klinisk forskningsetikk utvalg (12053003). Placental og navlestreng vev ble samlet fra friske givere som gjennomgikk keiserlige keisersnitt etter fullstendig graviditet; alle giverne ga informert samtykke.

Alle dyreforsøk ble godkjent av Etikkvurderingsutvalget for dyreforsøk (1206070993-2) ved Nagasaki University (Nagasaki, Japan). Forsøkene ble utført i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer.

Eks vivo ekspansjon av UCB-MSCs

Navlestrengsblod ble samlet fra leverte placentas ved bruk av sterile 18G nåler og 50 ml sprøyter inneholdt 1000 enheter heparin. Samlede blodprøver ble lagret på is og fortynnet med Dulbeccos fosfatbuffersaltvann (D-PBS) inneholdende 2 mM EDTA. Mononukleære celler ble isolert ved tetthetgradient sentrifugering ved bruk av Ficoll-Hypaque Plus-løsning (GE Healthcare). Fersk isolerte mononukleære celler ble suspendert i Dulbeccos modifiserte Eagle's middels lave glukose (DMEM-LG) (Wako) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Hyclone Laboratories, Inc.) og 1% penicillin / streptomycin (Life Technologies) og så podet inn i T75- eller T25-celledyrkolber med en tetthet på 8, 0-10 x 105 celler / cm2. Celler ble inkubert ved 37 ° C i 5% C02, og mediet ble forandret hver 3-4 dager. Vi fortsatte kulturen i ca 1 uke etter at fibroblastlignende celler dukket opp på bunnen av kolberne. Deretter ble disse fibroblastlignende celler oppsamlet under anvendelse av 0, 25% trypsin-EDTA og replated for ytterligere eks vivo ekspansjon. 2 nd eller 3 nd passasje celler ble brukt til eksperimenter, unntatt cellevækst analysen.

Eks vivo ekspansjon av WJ-MSCs

Navelstrømsvev ble samlet og lagret i Hanks balansert saltløsning (Life Technologies) ved 4 ° C. Etter fjerning av navlestifter og blodårer ble Whartons gelévev kuttet i små stykker (1-2 mm) og plassert i 6 eller 10 cm kulturretter belagt med 10 μg / ml human fibronektin. En liten mengde DMEM-LG-medier inneholdende 10% FBS og penicillin / streptomycin ble tilsatt til oppvasken, og cellene ble inkubert i 5% C02 ved 37 ° C. Etter inkubasjon over natten ble flere medier tilsatt til oppvaskene. Fibroblastlignende celler vokste ut fra vevet etter ca. 5 dager inkubering med medium endringer hver 3-4 dager. Cellene ble høstet ved bruk av 0, 25% trypsin-EDTA og replated for ytterligere eks vivo ekspansjon. Vi brukte 2 nd passasje celler for eksperimenter, unntatt celle vekst analysen.

Cellvekstanalyse

Første passasje UCB-MSCs og WJ-MSCs ble podet i 6-brønnsplater ved en tetthet på 3, 0 x 10 3 celler / cm2 og dyrket i 1 uke. Cellene ble samlet som en enkeltcellesuspensjon, og de totale celle tallene ble talt med NucleoCounter ® NC-100 TM .

Flowcytometri

For å karakterisere UCB-MSCs og WJ-MSCs, ble 2d-passasjerceller trypsinert for å danne en enkeltcellesuspensjon, og deretter farget med musmonoklonale antistoffer mot CD34-FITC (4H11), CD44-PE (IM7), CD45-PE HI30), CD73-FITC (AD2), CD90-FITC (eBio5E10) og CD105-PE (SN6) (eBioscience). De respektive isotype kontrollene ble brukt som negative kontroller. Etter vasking to ganger med PBS ble kvantitativ flytcytometrianalyse utført ved bruk av et LSRFortessa TM instrument (Becton Dickinson). Vi analyserte de overførte dataene ved hjelp av Cell Quest-programvaren (Becton Dickinson).

RT 2 Profiler PCR array

Totalt RNA ble isolert fra UCB-MSCs og WJ-MSCs ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen). Etter genereringen av cDNA ved bruk av RT 2 First Strand Kit (SABiosciences) ble RT 2 Profiler PCR-arrayet for human fibrose utført i henhold til produsentens instruksjoner (SABiosciences). Totalt var 84 nøkkelgener involvert i remodeling av vev under reparasjon og heling av sår, inkludert i gruppen. Tre separate eksperimenter ble utført og data ble analysert ved hjelp av et nettbasert analyseprogram (SABiosciences, //pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php).

Mus sårheling modell og celle implantasjon

Seks ukers gamle BALB / cSlc (nu-nu) mus ble kjøpt fra Japan SLC. Fire hudtykkelser med full tykkelse ble opprettet i dorsal hud ved hjelp av 5 mm diameter biopsi slag (Kai Industries). Deretter ble musene randomisert inn i 3 grupper og mottatt subkutane injeksjoner med 4 poeng rundt hvert sår: totalt 1, 0 x 10 5 UCB-MSCer i 50 μl medium (UCB-MSCs-gruppe), 1, 0 × 10 5 WJ-MSCs (WJ-MSCs-gruppe), eller bare 50 μl medium (kontrollgruppe). Sårene ble registrert ved hjelp av et digitalt kamera (Lumix DMC-GF3, Panasonic) 0, 1, 3, 5, 7, 10 og 14 dager etter behandling, og sårområdene ble målt ved hjelp av Photoshop CS6 Extended-programvare (Adobe-systemer). Sårvev ble høstet med 1 mm normale hudmarginer på forskjellige tidspunkter for følgende analyser.

Realtids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)

For å måle mRNA ekspressionsnivåene av flere gener assosiert med sårheling, høstet vi hudssvev for RT-PCR analyse 3 eller 7 dager etter behandling. Kort fortalt ble sårvev homogenisert ved bruk av Multi-beads shocker® (Yasui Kikai), og RNA-rensing ble utført ved anvendelse av ISOGEN2 (Nippon Gene) i henhold til produsentens protokoll. ReverTra Ace ® q-PRC RT kit med genomisk DNA-fjerner (TOYOBO) ble brukt til å fremstille cDNA fra det rensede totale RNA. RT-PCR ble utført ved bruk av en THUNDERBIRD SYBR qPCR-blanding (TOYOBO) og CFX96 Touch-sanntids-PCR-deteksjonssystem (Bio Rad). Primersekvensene som brukes til å kvantifisere genuttrykkningsnivåer er oppført i tilleggstabell 1.

Histologisk evaluering

For histologisk analyse ble musene drept 3, 7 og 14 dager etter behandling. De høstede sårvevene ble fikset i 4% paraformaldehyd for paraffininhulling. Seksjoner (6 μm tykk) ble brukt til forskjellige fargingsteknikker: hematoksylin-eosin (HE) -farging, Massons trichromfarging, Picrosirius-rød farging 26 og immunhistokjemi (IHC) farging for CD31 (ab28364, Abcam) og F4 / 80 (Cl: A3-1, Abcam). For IHC ble avdelinger deparaffinisert, inkubert i 20 minutter med 3% hydrogenperoksid for å blokkere endogen peroksidaseaktivitet, inkubert med Blocking One Histo (Nacalai Tesque) ved romtemperatur og deretter inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Alle seksjoner ble visualisert ved bruk av Histofin Simplestaining mouseMAX-PO (kanin eller rotte) (Nichirei Biosciences, Inc.) og 3, 3'-diaminobenzidin tabletter (Sigma-Aldrich). Stained seksjoner ble sett av mikroskopi (Olympus IX83, Olympus), og digitale bilder ble kjøpt med et DP80 kamera ved hjelp av cellSens-programvaren (Olympus). Picrosirius røde fargede seksjoner ble observert ved bruk av et polarisert mikroskop. HE-fargede seksjoner ble brukt til å evaluere reepitelialisering og granulering av sår. Bilder ble optimalisert globalt og samlet inn i figurer ved hjelp av Adobe Photoshop.

Western blots

For å måle proteinene på CD31 og F4 / 80 ble musene avlivet og sårvev ble høstet 7 dager etter behandling. Kort fortalt ble de høstede sårvev homogenisert ved bruk av Multi-beads shocker® og tilsatt T-PER-reagensen (Thermo Fisher Scientific) bestående av proteinase og dephosphoryleringsinhibitorer (Thermo Fisher Scientific). Totalt proteinlysater ble oppnådd etter eliminering av rusk ved filtrering med 0, 22 μm filtre (Millipore). Total protein (10 μg) ble separert ved bruk av en mini-protean TGX-fargelagget TM- gel (BioRad), og deretter overført til PVDF-membraner ved hjelp av Trans-Blot® Turbo TM- overføringssystemet (BioRad). Etter blokkering med PVDF-blokkeringsreagenset kan få signal ® (TOYOBO) i 1 time ved romtemperatur ble membranene inkubert med primære antistoffer mot CD31, F4 / 80 eller tubulin (Sigma-Aldrich) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av passende pepperrotperoksidase-konjugerte sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Ekspresjon ble visualisert ved kjemiluminescens med en digital luminescerende bildeanalysator (LAS-4000, GE Healthcare).

Statistisk analyse

Vesentlige forskjeller ble bestemt ved bruk av Studentens t- test, med p <0, 05 som statistisk signifikant. Alle data ble presentert som middel ± SEMs.

Tilleggsinformasjon

Hvordan å sitere denne artikkelen : Doi, H. et al. Kraft av navlestrengsblod- og Whartons gelé-avledede mesenkymale stamceller for scarless sårheling. Sci. Rep. 6, 18844; doi: 10, 1038 / srep18844 (2016).

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens