Anonim

Temaer

  • nanostrukturer
  • Proteinaggregering
  • Self-montering

Abstrakt

Hierarkisk montering av selvhelende klebende proteiner skaper sterke og robuste strukturelle og grensesnittmaterialer, men forståelse av molekylære design og struktur og eiendomsforhold av strukturelle proteiner forblir uklart. Avsløring av dette forholdet vil tillate rasjonell utforming av neste generasjon av genetisk konstruerte selvhelende strukturelle proteiner. Her rapporterer vi en generell selvhelbredelses- og samlingsstrategi basert på et flerfaset rekombinant proteinbasert materiale. Segmentert struktur av proteinet viser myke glycin- og tyrosinrike segmenter med selvhelbredende evne og harde beta-arksegmenter. De myke segmentene blir sterkt plastisert av vann, og senker selvhelbredelsestemperaturen nær kroppstemperaturen. De harde segmentene selvmonterer til nanokonfunnede domener for å forsterke materialet. Helbredelsesstyrken skalerer seg sublinearly med kontakt tid, som forholder seg til diffusjon og fuktighet av autohesjon. Funnet antyder at rekombinante strukturelle proteiner fra heterolog ekspresjon har potensial som sterke og repairable konstruksjonsmaterialer.

Introduksjon

Selvhelende materialer kan helt eller delvis helbrede skader påført dem, særlig ved å reparere sprekker 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 . Stive materialer som selvhelter i vått miljø vil i stor grad være til nytte for biomedisinske applikasjoner, særlig ved å forlenge implantatets levetid, men de fleste selvhelbredende polymerkemikalier er ikke egnet for vandige miljøer 10 . Stivhet kommer også på bekostning av dynamisk helbredelse: Svake intermolekylære interaksjoner resulterer i et mindre stivt materiale, men mer dynamisk helbredelse, og omvendt 3, 4 . Denne avviket fører til forslaget til en generell selvhelbredende strategi basert på et flerfasemateriale: Materialet skal ha harde og myke faser, med selvhelbredende evne innebygd i den myke fasen 3, 4 . Selv om denne strategien har blitt foreslått tidligere 3, 4, forblir flere trinns syntese og polydisperse molekylvektfordeling utfordringer for materialesyntese. Rekombinant ekspresjon gir imidlertid industriell skalaproduksjon uten å modifisere polymerisasjonstrinnene og med monodispers molekylvekt.

Undervanns selvhelbredende materialer finnes i naturen 11, og en betydelig forskningsinnsats har fokusert på å etterligne grensekjemien til marine kjeller 12, 13 . Men selvhelbredende proteiner er også kjent for å samle seg selv gjennom supramolekylær organisasjon, og forståelsen av rollen til denne supramolekylære selvsammenstillingen i selvhelbredelsesprosessen forblir begrenset. Vi foreslår at naturen bruker denne supramolekylære selvsammenstillingen for å oppnå stiv selvhelbredende strukturelle proteiner med myk / hard domeneseparasjon (figur 1A).

( A ) Skjematisk av supramolekylær selvmontering. ( B ) Aminosyresekvensen av proteinet som viser en segmentert kopolymerstruktur. Forkortelsene for enkeltbokstav aminosyre følger standardkonvensjonen. Selvmonterende β-arkregioner er fargede grønne og amorfe områder røde. ( C ) Det 18 kDa rekombinante proteinpulveret oppnås ved bruk av neste generasjons sekvensering og heterolog ekspression. ( D, E ) Det rekombinante protein oppløses i polare løsningsmidler ( D ) og kan støpes i forskjellige former ( E ). Materialet selvmonteres ved løsemiddelfordampning. ( F ) Hundebeinformet rekombinant proteinstråle etter halvering. ( G ) Strålen etter å ha presset sammen i varmt 45 ° C vann.

Full størrelse bilde

Nylig ble det funnet bevis på supramolekylær selvmontering i proteinkomplekset av blekksprut-ringtenner (SRT) 14, 15 . SRT-baserte materialer ble vist å ha flere interessante egenskaper som multifunksjonelle konstruksjonsmaterialer: a) høy elastisk modul (6-8 GPa i luft 14, 2-4 GPa under vann 16 ); b) i stand til å danne en sterk limbinding under vann 17 ; og c) en reversibel overgang mellom glass og gummi 18 . De gummiaktige egenskapene oppnås i fravær av hvilken som helst kovalent tverrbinding, men er et resultat av fysisk tverrbinding mellom β-arksegmenter, som selvmonterer i nanokonfunnede domener 14 . I ringtennene til europeisk vanlig blekksprut ( Loligo vulgaris ) ble det identifisert minst syv forskjellige proteiner, og primære sekvenser 18 ble oppnådd, som viser en segmentert kopolymerarkitektur. Utbyttet av dette proteinholdige materialet fra naturlige kilder er lavt (~ 1 g SRT fra en 5 kg blekksprut) og sammensetningen av det opprinnelige materialet varierer mellom blekksprutartene 19 . For å få en bærekraftig materialkilde og streng kontroll over proteinsammensetningen ble neste generasjons sekvensering (NGS) og heterolog rekombinant proteinuttrykk foreslått 14, 18 . Tidligere brukte vi differensialskanningskalorimetri (DSC) og dynamisk mekanisk analyse (DMA) for å vise at et rekombinant 18 kDa SRT-protein fra Loligo vulgaris (LvSRT-18kDA) har en glassovergangstemperatur på Tg ≈ 34 ° C når det plastiseres av vann . Materialet kan støpes i forskjellige former i sin gummiaktige fase eller alternativt støpes ved romtemperatur ved selvmontering i polare løsningsmidler 18 . Ved bruk av DMA ble det tørre materiale vist å ha en stabil lagringsmodul på E ' ≈ 1 GPa og et tapsmodul på E " ≈ 50 MPa til nedbrytningstemperaturen på T d ≈ 200 ° C 18 . Disse verdiene er sammenlignbare med høy tetthetspolyetylen ( E ' ≈ 1 GPa, E " ≈ 80 MPa ved 38 ° C 20 ).

I dette papiret rapporterer vi selvhelbredelse av dette rekombinante proteinet, som oppnås under milde forhold, ved å trykke i gummilagring (shear thinning) i akvatiske medier. Sfæriske sondeadhesjonstester viser underlinjær tidsavhengighet (≈t 1/2 ) og en kritisk glassovergangstemperatur (Tg) over hvilken sprekkheling i materialet kan gjentas flere ganger. Vi belyser den segmenterte kopolymerstrukturen av proteinet ved å vise at de myke amorfe områdene spiller en viktig rolle i selve helbredelsen av materialet, mens de hardt nanokonfinerte β-arkdomenene forsterker strukturen.

Resultater og diskusjon

Aminosyresekvensen, fra NGS 18, er vist i figur 1B. De segmenterte kopolymerblokkene deles ofte av prolinrester. De glycinrike områdene er amorfe, mens alanin-, valin-, serin-, treonin- og histidin (AVSHT) rike regioner er i stand til å danne p-ark 18 . Det rekombinante ekspresjon utføres ved kloning av LvSRT-genet i pET14b-vektor (novagen) og transformert til E. coli som beskrevet tidligere 18 . Single-trinns rensing av LvSRT-18kDA proteinutbytter på ~ 0, 5 g / L i biomasse (figur 1C). Størrelsen på det resulterende protein ble bekreftet ved bruk av SDS-PAGE (figur S1). SDS-PAGE er typisk følsom for proteiner med tydelig molekylvekt og med konsentrasjon på mer enn 10%. Siden ingen sidebånd ble observert, anslås proteinets renhet til å være minst 90%; molekyler med liknende molekylvekter kan imidlertid ikke skilles ved bruk av metoden. Proteinet kan oppløses i polare protiske løsningsmidler (figur 1D), spesielt 1, 1, 1, 3, 3, 3-heksafluoro-2-propanol (HFIP). Materialet kan støpes i forskjellige former ved selvmontering ved oppløsning av løsningsmiddel (figur 1E). Opptil 100 mg / ml kan oppløses i HFIP til viskositeten til løsningen blir uegnet til støping.

Kvalitativt ble automatisk selvhelbredelse observert i en brudddel. Etter støping ble en hundbeinprøve kuttet i to stykker (figur 1F). Når det plasseres i varmt 45 ° C vann, mykeres materialet og presses sammen igjen (figur 1G). Kvantitativ karakterisering av selvhelbredelsen ble gjort ved å måle krefter og energier som trengs for å skille to proteinflater etter at de er blitt sammenføyet. Til dette formål brukte vi sfæriske sonde-adhesjonstester 21, hvor en proteinbelagt glasskule (krumningsradius R = 20, 67 mm) ble presset mot en proteinbelagt flat glassoverflate under vann (fig. 2A og S2). Filmtykkelsen var ca. 10 μm. Overflatene ble presset sammen med en forspenningskraft på Fp = 0, 25 N for en kontakttid på t, og adhesjonskraften Fa ble registrert under tilbaketrekning (figur 2B). Ved å variere temperaturen, T, fra 17 ° C (< Tg ) til 70 ° C (> Tg ) og tid, t, logaritmisk mellom 5 s og 625 s, finner vi at F a faller betydelig når T < T g (under vann). Av alle de statistiske regresjonsmodellene som ble vurdert (tabell S1), fant vi ut at dataene (fig. S3) var best opptatt av en kraftlov av

( A ) Skjematisk av sfæriske sondeadhesjonstester som brukes til å karakterisere selvhelbredelsen mellom proteinfilmer. En sfærisk indenter ble lastet og losset mot en flat overflate nedsenket i avionisert vann. Begge overflatene ble belagt med 10 μm tykk proteinfilm. Krølningsradiusen til den sfæriske overflaten var 20, 67 mm. ( B ) Et eksempel på det målte styresignalet fra et klebende forsøk. Forspenningskraften Fp var 0, 25 N i alle eksperimenter. ( C ) Plot av F a som en funksjon av t ved T = 45 ° C. Dataene er fanget av en kraftlovregresjonsmodell (Eq. 1). Feilstenger viser standardavviket til målingene (repetisjoner: 6). ( D ) Prefaktor c (T) som en funksjon av temperatur. Feilstenger viser 95% konfidensintervallet fra parameterestimeringen. ( E) Repeterbarhet og effekt av pH på autohesjonen ved 70 ° C. ( F) Autohesion i varierende NaCl-konsentrasjoner. Feilstenger viser standardavviket til målingene (prøver: 2, repetisjoner pr. Prøve: 10).

Full størrelse bilde

hvor c er en temperaturavhengig prefaktor, t er i sekunder, k = 0, 36 ± 0, 02 og F 0 = -0, 04 ± 0, 03 N er temperaturuavhengige konstanter, og e er residualet (figur 2C). Ved temperaturer 17-30 ° C < T g, målt vi svært lite vedheft; Følgelig c ≈ 0 N. Omkring 37 ° C ≈ T g, c begynner å øke betydelig. Legg merke til at den negative F 0 er unysisk og kan være en artefakt av regresjonsmodelleringen eller en systematisk målefeil; Den nest beste regresjonsmodellen ble vurdert

.

En ideell elastisk modell forholder Fa til den kritiske belastningsenergiutslippshastigheten Gc gjennom Johnson-Kendall-Roberts (JKR) teorien med F a ~ G c for en sfærisk probe og F a ~ G c 1/2 for en sylindrisk flat sonde 21, 22 . Vår proteinfilm er viskoelastisk, slik at disse relasjonene ikke forventes å holde. Imidlertid, forutsatt at forholdet er mellom en sfærisk og en sylindrisk sonde, for stor t finner vi G 0, 38-0, 76, et område som inneholder de ofte funnet G- t 1/2, en kraftlov knyttet med diffusjon og fukting modeller for autohesion (selvbinding) 23 . For makromolekyler er det viktig å skille mellom makro-brunisk bevegelse (diffusjon av molekyler) og mikro-brunisk bevegelse (diffusjon av segmenter) 24 . Eksistensen av tverrbindinger i materialet (intermolekylære β-ark-koblinger i vårt tilfelle) kan hemme makro-brunisk bevegelse 23, slik at solid / fast fukting og mikro-Brownian blir som de plausible autohesjonsmekanismer for det rekombinante LvSRT-protein.

For å undersøke betydningen av medier for selvhelbredelsen, må vi gjentatte ganger måle autohesion med t = 25 s og T = 70 ° C i forskjellige medier som tørt, deionisert vann (DI) vann med varierende pH (5, 7 og 10), og DI vann med varierende konsentrasjoner av NaCl mellom 0, 0 og 0, 8 M. Høy temperatur på T = 70 ° C ble valgt for å sikre full overgang til gummilagstilstanden. Resultatene fra pH-eksperimenter er oppsummert i figur 2E. Det er en dramatisk økning i autohesjon etter tilsetning av vann, som forventes på grunn av senket T g ved å plastisere effekten av vannet. De første forsøkene i vann viser en stor spredning i målingene, noe som indikerer plastiske deformasjoner i filmene når det gjentas flere ganger på samme punkt, men generelt var adhesjonen ikke følsom overfor milde endringer i pH. Ved alkaliske forhold (pH 10) faller adhesjonen noe, noe som er i overensstemmelse med den tidligere observerte nedgang i adhesjon av det native SRT-proteinkomplekset på glass når pH> 10. Den observerte dråpene i adhesjon er i samsvar med β-arks nanodomainer som forstyrres under alkaliske forhold. Effekten av tilsatt NaCl på autohesjonen er oppsummert i figur 2F. Ingen signifikant endring i autohesjon ses når ionkoncentrasjonen økes. Vi har tidligere rapportert at steady state adhesjon ( t ≈ dager) av innfødte SRT til glassrør reduseres når ionkoncentrasjonen økes; Dette er ikke i strid med våre nåværende resultater, men viser at stabiliteten av SRT til glass er stabil ved hydrogenbinding, mens andre selvklebende fenomener (f.eks. kjedeforvridninger eller fuktighet) begrenser den dynamiske adhesjonsstyrken.

For å forstå effekten av diffusjon så vel som intermolekylære interaksjoner i det amorfe domenet som en funksjon av temperatur, utførte vi molekylære dynamikk simuleringer. Vi oppnådde kraftforlengelseskurver for den amorfe regionen av LvSRT-18kDA-proteinet (figur S4A). Vi valgte her det gjentatte motivet YGYGGLYGGLYGGLGY. Denne spesielle sekvensen er valgt fordi den representerer en sammensetning som er høy i glycin (fleksibilitet) og tyrosin (hydrogenbinding 25 ) står for mer enn 60% av totale aminosyrer. Hydrogenbindingsnettene dannet mellom peptidkjeder gjennom en simulering måles ved autokorrelasjonsfunksjon (ACF) vist i figur S4B. Figuren viser tydelig en dråpe ved 320 K, som stemmer overens med den observerte glassovergangstemperaturen i DSC-eksperimenter. Det er således klart at både hydrogenbinding og kjedeforankring i amorfe domener spiller en rolle i adhesjonsmekanismen.

Vi belyser deretter rollen som de selvmonterte β-arkdomenene i det selvhelende materialet ved hjelp av røntgendiffraksjon (XRD). Selv etter at filmen er oppvarmet til gummiaktig tilstand i vann og deretter tørket, bekrefter XRD eksistensen av ≈ 3 nm bestilte domener (figur 3A), i henhold til Scherrer-ligningen 26 . Lignende resultater har tidligere blitt oppnådd for Humboldt blekksprutproteiner 15 . For å bekrefte naturen til disse nanodomene brukte vi også Fourier transform infrarødspektroskopi (FTIR) og fant et stort amid I-bånd på rundt 1640 cm -1 (figur 3B og S5). Analyse av Fourier-selvdekonvolutterte spektrum av amid I-båndet 27, 28 viser at de fleste bidrag til dette båndet hovedsakelig er fra β-ark og sekundært fra tilfeldig spole og slå konformasjoner. På samme måte som silke 28 er en topp rundt 1625 cm -1 tilordnet stablet antiparallelle p-arkstrukturer. I figur 3B binder beta-arket i området 1610-1630 cm-1, i samsvar med antiparallellarrangementet. Videre favoriserer den betydelige mengden svinger også det antiparallelle arrangementet.

( A ) XRD-spektrum med toppintensiteter merket med krystallografiske retninger. ( B ) FTIR spektrum av amidbåndet. ( C ) Sammenligning av 13C-NMR spektra ved romtemperatur (RT), 45 ° C og 75 ° C og to forskjellige avslapningsforsinkelser d i våte forhold.

Full størrelse bilde

I en semikrystallinsk polymer kan ko-krystallisering gi opphav til en meget stor økning i den selvheftende adhesjonsenergien 29 . Ved ko-krystallisering krystalliseres kjeder av samme natur, som først er på motsatte sider av grensesnittet, i en enkelt krystallitt. For å spørre effekten av temperatur på p-ark nanodomainene i våte miljøer, brukte vi solid-state carbon-13 atommagnetisk resonans (13C-NMR). Kryp polarisasjon magisk vinkelspinning (CP-MAS) viser nesten ingen forandring når det våte materialet oppvarmes fra romtemperatur til 75 ° C (figur 3C), og spektret er veldig lik, selv når materialet er tørt (figur S6 ). CP-MAS er følsomt bare for bestilte (dvs. b-ark) domener av materialet, og viser at det er liten endring i de bestilte domenene ved oppvarming. Tvert imot, vanlig magisk vinkelspinning (MAS) 13C-NMR i følsom for både bestilte og uordnede (dvs. amorfe områder av materialet), og viser skift og intensitetsendringer i spektrene ved oppvarming av det våte materialet (figur 3C ). Videre sammenligne MAS-spektra med korte (5 s) og lange (30 s) avslapningsforsinkelser d, finner vi at karbonyltoppen rundt 172 ppm med kort avslapningsforsinkelse er relativt grunne ved 75 ° C sammenlignet med romtemperatur, men forskjellen er mindre uttalt med den lange avslapningsforsinkelsen. β-ark domener skal ha lengre T1 avspenningstider, slik at de fleste endringer i karbonyl-toppen kan tilskrives de amorfe regioner med det meste glycinrester. Samlet sett er begge MAS- og CPMAS-resultatene konsistente med antagelsen om at de fleste endringer ved oppvarming er i de amorfe områdene av materialet, mens de bestilte domenene forblir intakte ved 75 ° C. Følgelig finner vi det usannsynlig at samkrystallisering bidrar til selvhelbredelsen.

Til slutt sammenlignet vi den selvhelbredende oppførselen til 18 kDa proteinet til et rekombinant 22 kDa protein med lignende tosegmentert arkitektur og mekaniske egenskaper (E '≈ 1 GPa i tørr tilstand). Hovedforskjellen mellom proteinene er at segmentets grenser og repeteringsmotiver er mindre klare i 22 kDa proteinet (figur S7A). Likevel viser 22 kDa-proteinet sammenlignbar tidsadferdighet i adhesjonsmålingene (figur S7B). Dette bekrefter at den generelle harde / myke designen er viktigere for selvhelbredelse enn individuelle motiver eller deres plasseringer.

Sammendrag, selvhelbredende strukturelle høyproteinproteiner kan gi nye mekaniske egenskaper for kliniske anvendelser som ortopediske anordninger for reparasjon 30 og behandlingsstrategier som nye biologisk nedbrytbare matriser for å levere og stimulere bioaktive molekyler for sårheling.

metoder

Rekombinant proteinuttrykk

En enkelt koloni ble inokulert og dyrket over natten i 250 ml LB med ampicillin (100 μg / ml). Den overnattende kulturen ble inokulert i en 80 L fermentor inneholdende LB / ampicillin (100 ug / ml). Kulturen ble dyrket ved 37 ° C til en OD600 på 0, 6 da IPTG ble tilsatt. Cellene ble deretter pelletert ved 10.000 rpm. i 15 minutter og vasket to ganger med 20 mM Tris buffer pH 8. Cellepellet ble resuspendert i 50 ml lysisbuffer (50 mM Tris pH 7, 4, 200 mM NaCl, 1 mM PMSF, 10 mg / ml lyzosym, 0, 1 mg / ml DNAse I og 2 mM EDTA) og lysert ved bruk av en høytrykkshomogenisator (Microfluidics M-110EH-30 mikrofluidisator). De lyserte celler ble pelletert ved 14000 rpm. i 1 time ved 4 ° C. Pelleten ble deretter vasket to ganger med urea-ekstraksjonsbuffer (100 mM Tris pH7, 4, 5 mM EDTA, 2 M urea, 2% (vol / vol) Triton X-100) og deretter to ganger med en vaskebuffer (100 mM Tris pH7 .4, 5 mM EDTA). Etter vaskestrinn ble rekombinante proteiner tørket ved å bruke en Freezezone 12 (Labcono, Kansas City, MO). Rekombinante proteiner med ~ 90% renhet ble oppnådd på denne måte og utbytter ble estimert til ~ 0, 5 g / L.

Healing hund beinformet prøve

20 mg rekombinant 18 kDa SRT protein (figur 1C) ble oppløst i 1, 1, 1, 3, 3, 3-heksafluor-2-propanol (HFIP, figur 1D) og støpt på en flat overflate. Etter oppløsningsmiddelfordampning i kjemisk avtrekksdeksel ble SRT-filmene skyllet med DI vann. Proteinet ble støpt til en 15 mm hundebenform i en PDMS-form (figur 1E) ved 75 ° C med di vann i overskudd under 1 MPa trykk i 10 minutter. Etter støping ble prøven tørket under omgivelsesbetingelser og ble kuttet i en halv med et knivblad (figur 1F). De to delene ble presset sammen igjen i formen (ved 45 ° C> Tg ) ved å tilsette 10 ml DI vann til kuttområdet og påføre 1 MPa i 10 minutter (figur 1G).

Løsningsmiddel avstøpning filmer

For adhesjonsmålinger ble flate 1 mm tykke mikroskopglas og glidelås i planformet konvekse linser (Edmund-Optics # 45-095, ubelagt, R = 20, 67 mm) belagt med løsningsmiddelstøpte proteinfilmer (Fig. S1, innsett). Glidene ble først kuttet i ca. 20 mm x 25 mm stykker og tørket rent med isopropylalkohol. Linsene ble gjenbrukt i flere eksperimenter, og mellom forsøkene ble linsene grundig rengjort ved bruk av ultralyd-aktivert aceton, HFIP og isopropylalkohol. Det rensede rekombinante protein ble oppløst i HFIP (20 mg / ml). 40 μl oppløsning ble dispensert på begge substrater, og løsningsmidlet ble igjen fordampet på en 65 ° C varmeplade i minst 10 minutter i en kjemisk avtrekksdeksel. Deretter ble ytterligere 40 μl dispensert på begge substrater og prøvene ble igjen tørket på kokeplaten i minst 30 minutter. Den endelige midlere tykkelsen av filmen ble estimert til å være 10 um; Det kan imidlertid observeres at et distinkt ringfargemønster 31 var observert og filmene ble alltid probet nær senteret, så den effektive filmtykkelse under kontaktområdet var mye mindre.

Adhesjonsmålinger

Et proteinbelagt flate glassglass ble montert ved bruk av et cyanoakrylatlim (Loctite 498) til bunnen av en 35 mm petriskål og den sfæriske glasslinsen ble montert på en aluminiumadapter. Aluminiumsadapteren ble gjenget og skrudd på en lastcelle (Transduserteknikker GSO-250). Sensorens støynivå på lastcellen var mindre enn 1 mN. Petriskålen ble fylt med 4 ml avionisert vann. Et termoelement av typen K-type (nøyaktighet ≈ 1 ° C) ble nedsenket i vannet og basert på den målte temperaturen regulerte en proporsjonal integrert differensialstyring temperaturen på vannet ved hjelp av eksterne varme- og kjøleelementer. En datamaskinstyrt motorisert scene (Newport MFA-CC) ble brukt til å laste og losse den sfæriske filmen mot det flate lysbildet, med en hastighet på 20 μm / s. Fig. S2 viser et bilde av måleoppsettet. En datamaskin registrerte lastcellesignalet ved hjelp av et signaloppkjøpskort og var ansvarlig for styring av motorisert trinn. Hvert eksperiment besto av lasting inntil forbelastningen ble nådd, venter på kontakttid, t, og deretter lossing. Preload ble holdt konstant (0, 25 N) i alle tester. Effekter av oppdrift (<1 mN) og kapillære krefter i luft-væskegrensesnittet (<2 mN) var synlige i lastcellens signal, men deres effekt på målingene var mindre. Adhesjon ble målt som maksimal strekkraft målt under losning. Når målingen gjentas med en prøve, er måleforplantningsevnen innen 2 mN. Vedheftingen ble målt ved åtte forskjellige temperaturer: 17, 23, 30, 37, 45, 53, 61 og 70 ° C. En prøvekombinasjon (objektiv og flatt lysbilde) ble brukt for hver temperatur. Ved hver temperatur ble syv forskjellige kontakttider testet: 5 s, 11 s, 25 s, 56 s, 125 s, 280 s og 625 s. Hver kontakttid ble testet seks ganger, og forsøkene ble bestilt i en balansert Latin-firkantet rekkefølge (Tabell S2) for å minimere overføringseffekter fra å undersøke samme sted flere ganger. Rådataene fra disse målingene er plottet i figur S3. For de fleste temperaturer var det en liten økning i adhesjon med gjentatte forsøk; dette skyldtes sannsynligvis økning i kontaktområdet på grunn av plastiske deformasjoner i filmen. Flatfilmene ble observert etter forsøkene, og fra noen av dem kunne probepunktet lokaliseres, hvilket videre indikerer at plastiske deformasjoner oppsto under probingen. For pH-eksperimentene ble det prøvet et prøvepar (T = 70 ° C, t = 25 s) i tørt, DI-vann, DI-vann med pH 5 og DI-vann med pH 10 i den rekkefølge. Mellom forsøkene ble mediene endret og latt å balansere tilbake til 70 ° C, noe som tok omtrent 15 minutter. Målet ble gjentatt 10 ganger i hvert medium. HCI og NaOH ble brukt til titrering. Tilsvarende ble varierende NaCl-konsentrasjoner testet i forskjellige medier: tørr, DI-vann, DI-vann med 0, 05 M NaCl, DI vann med 0, 2 M NaCl og DI vann med henholdsvis 0, 8 M NaCl. NaCl-eksperimentene ble gjentatt med fire prøver.

Molekylære dynamikk simuleringer

Alle molekylære dynamiske (MD) simuleringer (Fig. S4) ble utført med Gromacs simuleringsmotor v.4.5.5 32 ved bruk av OPLS-AA kraftfelt 33 og SPC-vannmodellen 34 . Periodiske grensebetingelser ble påført i alle retninger sammen med partikkel-Mesh Ewald summeringer 35 for langdistanse elektrostatikk (> 1 nm). Van der Waals styrker ble modifisert med et skiftpotensial. Integreringstidstrinnet var 2 fs. V-rescale-type termostater for peptid- og vannmolekyler og en enkelt Parrinello-Rahman-type barostat (isotropisk, 1 bar) ble anvendt for henholdsvis temperatur og trykkkoblinger. Obligasjonsbegrensninger ble påført med LINCS-algoritmen. Den simulerte amorfe peptidsekvensen inneholdt 16 aminosyrer: YGYGGLYGGLYGGLGY. En enkelt peptidkjede ble først bygget som en spole med nøytrale N- og C-termini. Kjeden ble deretter energiminimert i vakuum ved bruk av den bratteste nedstigningsalgoritmen. Fem flere kopier av denne peptidkjeden ble tilsatt i simuleringsboksen og deretter arrangert i en tilfeldig spolt / inntrappet tilstand for å etterligne en polymer-smeltetype morfologi. Peptidkjedene ble en gang mer energi minimert og deretter simulert i vakuum med MD i 4 ns for rask fjerning av de mest uønskede geometriske konformasjoner. Disse kjedene ble deretter overført til en rektangulær boks med 20 nm × 8 nm × 8 nm størrelse og solvatisert med 42 317 SPC type vannmolekyler ved pH = 7. Ingen saltioner ble tilsatt for å etterligne eksperimentelle betingelser. Etter en annen runde med energiminimering ble den solvatiserte boksen ligevibrert i 10 ns ved bruk av et NPT-ensemble ved 1 bar trykk og 300 K temperatur. Etter ekvilibrering ble de 6 oppløste peptidkjedene trukket bort fra hverandre langs x-aksen ved å bruke styrt MD med et NVT-ensemble ved et temperaturområde som dekker 280 K til 330 K med 10 K intervaller. Peptidkjedene ble trukket bort fra deres spiralformede konformasjon på en slik måte at 3 kjeder ble trukket i -x retning, mens den andre 3 i + x-retningen med en hastighet på 1 nm / ns. I alt ble 2 harmoniske fjærer med 500 kJ / mol / nm 2 stivhet plassert midt på massen av tre ryggradsterminatomer som tilhørte de 3 peptidene trukket i en bestemt retning. Forskjæringen av harmoniske fjærer med hensyn til deres referanseposisjoner og de resulterende trekkstyrker ble registrert under simuleringen. Integralene til disse kraftforskyvningskurver ble beregnet for å estimere seigheten, dvs. den nødvendige energiinngangen for å skille peptidkjedene fra hverandre. Videre ble antall peptidpeptid-hydrogenbindinger (med 0, 35 nm avstand og 30 graders vinkelgrenser) og deres autokorrelasjonsfunksjoner (ACF) beregnet ved bruk av baneutgangen. I følge definisjonen av van der Spoel et al. 36 antok ACF at hydrogenbindingene var av avbrutt type, dvs. de fikk lov til å bryte og omforme under simuleringen. En ACF-kurve indikerte relevansen mellom hydrogenbindingsnettene dannet mellom peptidkjeder gjennom en simulering. Med andre ord viste de hvor stabile peptidpeptid-hydrogenbindingsnettene var ved en bestemt temperatur.

Røntgendiffraksjonspektroskopi

Røntgendiffraksjon (WAXS) -data ble samlet fra 500 μm SRT-filmer i en Rigaku DMAX-Rapid II-mikrodiffraktometer ved bruk av CuKa-kilde og 30 μm kollimator med 10 minutters eksponering ved 50 kV og 40 mA. Dataene analyseres med MDI Jade røntgendiffrasjonsprogramvare.

Dempet totalreflektans Fourier transformer infrarødspektroskopi

Spektraldata (Fig. S5) ble samlet (Thermo Scientific Nicolet 6700 FT-IR) under dempet totalrefleksjon (diamantkrystall) modus ved bruk av Happ-Genzel apodisering med 4 cm -1 oppløsning fra wavenumber 400 til 4000 cm -1 . For hvert spektrum er 256 skanninger lagt sammen.

Fourier-selvdekononvolution (FSD) og andre derivat av amid-I-båndet (1580-1706 cm- 1 ) ble utført ved hjelp av OMNIC-programvare (Thermo Scientific, v7.3). Andre derivater ble oppnådd fra det opprinnelige amid-I-spektret, og et ni-punkts Savitsky-Golay utjevningsfilter av polynom grad 5 ble påført. FSD ble utført med Lorentzian linjeform med 25 cm -1 båndbredde og en forbedringsfaktor for 2. kurvepassing ble utført som beskrevet andre steder 27, 28 . Individuelle bånd ble montert på dedekonverterte spektra 37 og ble tilordnet sekundære strukturelle komponenter 27 . Antallet og posisjonen til de tilpassede bånd ble oppnådd fra de andre derivatspektraene, hvor minima i de andre derivatspekterene korresponderte med de maksimalt tilpassede bånd i dedekonverterte spektra. Kurvmontering ble utført i OriginPro 8.5-programvare ved montering av gauss ved en ikke-lineær minst-kvadrering metode. Først ble de første båndposisjonene (tatt fra det andre derivatet) løst, og bredden og høyden ble etterlatt som fri parameter. Deretter fikk båndposisjonene å endres innen ± 2 cm -1 rekkevidde ved hjelp av den innebygde Levenberg-Marquardt-algoritmen. De relative områdene av enkeltbåndene ble brukt i beregningen av fraksjonen av sekundære strukturegenskaper.

Kjernemagnetisk resonansspektroskopi

Solid-state NMR-målinger ble gjort ved bruk av Bruker Avance-300 med 1 H driftsfrekvens på 300, 43 MHz og 75, 54 MHz for 13C-kjøring TopSpin 1.3. Instrumentet ble utstyrt med en 4 mm H / X CPMAS probe. Prøven ble fremstilt i en zirkoniumrotor med Vespel Kel-F og spunnet ved 6, 5 kHz. Datainnsamlingsparametrene for 13C MAS NMR-spektrene var: Bruker pulsprogram "hpdec.av", 2k poeng med oppkjøpstid på 20 ms og spektralbredde på 50 kHz, 13C puls på 4 μs, avslapningsforsinkelse på 5 og 30 sekunder, og 8 500-11 500 skanninger. 13C-dataene ble kjøpt med en 1 H-avkobling med 66 kHz SPINAL-128. For 13C CPMAS NMR-spektra var Bruker pulsprogram "cp.av", forsinkelse på 5 sek og kontakttid på 1 ms. De andre parametrene var de samme som MAS-spektrene. NMR-dataene ble behandlet med LB = 30 Hz og nullfylt til 32k poeng. Ved testing av materialet i våte forhold var det fullstendig mettet med vann.

referanser

  1. 1.

    Hager, MD, Greil, P., Leyens, C., Van Der Zwaag, S. & Schubert, USA Selvhelbredende materialer. Adv. Mater. 22, 5424-5430 (2010).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  2. 2.

    Ge, T., Pierce, F., Perahia, D., Grest, G. & Robbins, M. Molekylær dynamikk simuleringer av polymer sveising: Styrke fra grensesnittet entanglements. Phys. Rev Lett. 110, 98301-98305 (2013).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  3. 3.

    Chen, Y., Kushner, AM, Williams, GA & Guan, Z. Multiphase-design av autonome selvhelende termoplastiske elastomerer. Nat. Chem. 4, 467-472 (2012).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  4. 4.

    Hentschel, J., Kushner, AM, Ziller, J. & Guan, Z. Selvhelende supramolekylære blokk-kopolymerer. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 10561-10565 (2012).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  5. 5.

    Cordier, P., Tournilhac, F., Soulié-Ziakovic, C. & Leibler, L. Selvhelbredende og termoreversibel gummi fra supramolekylær samling. Nature 451, 977-980 (2008).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  6. 6.

    Chen, X. et al. Et termisk re-mendable tverrbundet polymermateriale. Science 295, 1698-1702 (2002).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  7. 7.

    Ghosh, B. & Urban, MW selvreparerende oksetan-substituerte chitosan-polyuretanettverk. Science 323, 1458-1460 (2009).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  8. 8.

    White, S. et al. Autonom helbredelse av polymerkompositter. Nature 409, 794-797 (2001).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  9. 9.

    Toohey, KS, Sottos, NR, Lewis, JA, Moore, JS & White, SR Selvhelende materialer med mikrovaskulære nettverk. Nat. Mater. 6, 581-585 (2007).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  10. 10.

    Jinglei, Y., Keller, MW, Moore, JS, White, SR & Sottos, NR Mikroinkapsling av isocyanater for selvhelbredende polymerer. Makromolekyler 41, 9650-9655 (2008).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  11. 11.

    Holten-Andersen, N., Fantner, GE, Hohlbauch, S., Waite, JH & Zok, FW Beskyttende belegg på utvidbare biofiber. Nat. Mater. 6, 669-672 (2007).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  12. 12.

    Lee, BP, Messersmith, PB, Israelachvili, JN & Waite, JH Musling-inspirerte Lim og Coatings. Annu. Rev. Mater. Res. 41, 99-132 (2011).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  13. 1. 3.

    Ahn, BK, Lee, DW, Israelachvili, JN & Waite, JH Overflateinitiert selvhelbredelse av polymerer i vandige medier. Nat. Mater. 13, 1-6 (2014).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  14. 14.

    Guerette, PA et al. Fremskynder utformingen av biomimetiske materialer ved å integrere RNA-seq med proteomikk og materialvitenskap. Nat. Biotechnol. 31, 908-915 (2013).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  15. 15.

    Guerette, PA et al. Nanokonfunnet β-ark Mekanisk forsterker det supra-biomolekylære nettverket av robuste blekksprut Sucker Ring-tenner. ACS Nano 8, 7170-7179 (2014).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  16. 16.

    Miserez, A. et al. Mikrostrukturell og biokjemisk karakterisering av nanoporøse sukkerringene fra Dosidicus gigas. Adv. Mater. 21, 401-406 (2009).

      • CAS
      • Artikkel
      • Google Scholar
  17. 17.

    Pena-Francesch, A. et al. Trykkfølsom adhesjon av et elastomert proteinkompleks utvunnet fra blæksprutte tenner. Adv. Funct. Mater. 24, 6227-6233 (2014).

      • CAS
      • Artikkel
      • Google Scholar
  18. 18.

    Pena-Francesch, A. et al. Materialer Fabrication fra native og rekombinante termoplastisk blekksprut Proteiner. Adv. Funct. Mater. 24, 7401-7409 (2014).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  19. 19.

    Demirel, M., Cetinkaya, M., Pena-Francesch, A. & Jung, H. Nylige fremskritt i nanoskala-bioinspirerte materialer. Macromol. Biosci. 15, 300-311 (2015).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  20. 20.

    Sewda, K. & Maiti, SN Dynamiske mekaniske egenskaper av høy tetthetspolyetylen og teak-tre melkompositter. Polvm. Okse. 70, 2657-2674 (2013).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  21. 21.

    Johnson, K., Kendall, K. & Roberts, A. Overflateenergi og kontakt av elastiske faste stoffer. Proc. R. Soc. London. Ser. A, Math. Phys. Sci. 324, 301-313 (1971).

      • Google Scholar
  22. 22.

    Maugis, D. & Barquins, M. Frakturmekanikk og tilslutning av viskoelastiske legemer. J. Phys. D Appl. Phys. 11, 1989-2023 (1978).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  23. 23.

    Stacer, RG & Schreuder-Stacer, HL Tidsavhengig autohesion. Int. J. Frakt. 39, 201-216 (1989).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  24. 24.

    Anand, JN & Karam, HJ Interfacial Kontakt og Binding i Autohesion I - Kontaktteori. J. Adhes. 1, 16-23 (1969).

      • Artikkel
      • Google Scholar
  25. 25.

    Tempo, CN et al. Tyrosin-hydrogenbindinger bidrar sterkt til proteinstabilitet. J. Mol. Biol. 312, 393-404 (2001).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  26. 26.

    Scherrer, P. Bestimmung der Grösse und der inneren Struktur von Kolloidteilchen mittels Röntgenstrahlen. Göttinger Nachrichten Gesell. 2, 98-100 (1918).

      • Google Scholar
  27. 27.

    Goormaghtigh, E., Cabiaux, V. & Ruysschaert, J.-M. i subcellulær biokjemi volum 23 . Fysisk-kjemiske metoder i studien av biomembraner 329-362 (Springer, 1994).

      • Google Scholar
  28. 28.

    Hu, X., Kaplan, D. & Cebe, P. Bestemmelse av beta-arkkrystallinitet i fibrøse proteiner ved termisk analyse og infrarødspektroskopi. Makromolekyler 39, 6161-6170 (2006).

      • CAS
      • Artikkel
      • Google Scholar
  29. 29.

    Creton, C. i Polym. Surfaces Interfaces III (Richards, RW & Peace, SK) 101-147 (Wiley, 1999).

      • Google Scholar
  30. 30.

    Perrone, GS et al. Bruken av silkebaserte enheter for bruddfiksering. Nat. Commun. 5, 3385 (2014).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  31. 31.

    Deegan, RD et al. Kapillærflyt som årsak til ringflekker fra tørkede væskedråper. Nature 389, 827-829 (1997).

      • CAS
      • Artikkel
      • Google Scholar
  32. 32.

    Hess, B., Kutzner, C., van der Spoel, D. & Lindahl, E. GROMACS 4: Algoritmer for høy effektiv, balansert og skalerbar molekylær simulering. J. Chem. Theory Comput. 4, 435-447 (2008).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  33. 33.

    Jorgensen, WL & Tirado-Rives, J. OPLS Potensielle Funksjoner for Proteiner. Energiminimiseringer for krystaller av cykliske peptider og Crambin. J. Am. Chem. Soc. 110, 1657-1666 (1988).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  34. 34.

    Berendsen, HJC, Postma, JPM, Gunsteren, WF van & Hermans, J. i intermolekylære styrker (red. Pullman, B.) 331-342 (Reidel, 1981).

      • Google Scholar
  35. 35.

    Darden, T., York, D. & Pedersen, L. Partikkelmaske Ewald: En N ⋅ log (N) metode for Ewald summer i store systemer. J. Chem. Phys. 98, 10089-10092 (1993).

      • CAS
      • Artikkel
      • Google Scholar
  36. 36.

    Van der Spoel, D., van Maaren, PJ, Larsson, P. & Timneanu, N. Thermodynamics of Hydrogen Bonding In Hydrophilic and Hydrophobic Media. J. Phys. Chem. B 110, 4393-4398 (2006).

      • CAS
      • PubMed
      • Artikkel
      • Google Scholar
  37. 37.

    Lórenz-Fonfría, V. Í. A. & Padrós, E. Kurvepassing av Fourier-manipulerte spektra som omfatter apodisering, utjevning, avledning og dekonvolution. Spectrochim. Acta - Del A Mol. Biomol. Spectrosc. 60, 2703-2710 (2004).

      • Artikkel
      • Google Scholar

Last ned referanser

bekreftelser

VS ble støttet av Jenny og Antti Wihuri Foundation, Walter Ahlström Stiftelsen og Finlands Akademi (stipend 268685). MS ble støttet av NSF CMMI-1130520 støtten. MCD, AP og HJ ble støttet av Office of Naval Research (N000141310595) og Pennsylvania State University. Vi takker Walter Dressick og David Allara for deres innsiktige kommentarer til utkastet til dette manuskriptet.

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens