Anonim

Temaer

  • Levering av legemidler
  • Virkningsmekanismen

Abstrakt

Fremskritt i nanostrukturerte materialer har lett til flere anvendelser av nanopartikler (NP). Hudpenetrasjon av NP er en avgjørende faktor for å designe egnede topiske antibakterielle midler med lav systemisk toksisitet. Tilgjengelige rapporter fokuserer på størrelsesavhengig hudpenetrasjon av NP, hovedsakelig gjennom follikulære veier. Her demonstrerer vi for første gang en bevis-av-konseptstudie som innebærer variasjoner i hudpermeabilitet og diffusjonskoeffisienter, penetrasjonshastigheter og dybde-inntrenging av forskjellige formet sølv-NP (AgNP) via intercellulære veier ved bruk av både in vitro og in vivo modeller. Den antimikrobielle aktiviteten til AgNP er kjent. Ulike former for AgNPs kan vise forskjellige antimikrobielle aktiviteter og hudpenetreringskapasiteter avhengig av deres aktive metallfasetter. Betraktning av formenavhengigheten av AgNP i antimikrobielle formuleringer kan bidra til å utvikle et ideelt topisk middel med høyest effektivitet og lav systemisk toksisitet.

Introduksjon

Oppmuntrende resultater har nylig blitt rapportert angående bakteriedrepende aktivitet av sølv nanopartikler (AgNPs) av enten enkel eller sammensatt natur 1, 2 . Deres anvendelse som aktuelle antimikrobielle midler for å kontrollere kolonisering og proliferasjon av mikrobielle patogener, inkludert multidrugsresistente organismer, er antatt å revolusjonere brennsårbehandling. AgNPs ble vist å gjennomgå størrelsesavhengige interaksjoner med HIV-I og gram-negative bakterier 3, 4 . I tillegg rapporterte vår gruppe for første gang den komparative studien om bakteriedrepende egenskaper av sølvnanopartikler av forskjellige former, og viste at AgNP også gjennomgår formavhengige interaksjoner med bakterier 5 . Avkortede trekantede sølvnanoplater med et {111} gitterplan som basalplanet viste sterkeste biocidvirkningen sammenlignet med sfæriske og stangformede nanopartikler og med Ag + . Overraskende, selv om AgNPs ble rapportert å trenge gjennom intakt og skadet menneskeskinn, så vidt vi vet, finnes det ingen rapport om form- eller størrelsesavhengige hudinntrengninger som involverer AgNPs. Hudpermeasjonsstudier har avslørt absorpsjon av NP gjennom intercellulære og follikulære gjennomtrengningsveier (figur 1A) 6 . I den intercellulære vei foretrekker faste NP'er ofte den tortuøse penetreringsruten gjennom corneocytter, anordnet i "murstein og mørtel". Disse ordningene hindrer effektiv transport av faste NP gjennom lagene av corneocytter (stratum corneum, 10-15 μm) innebygd i lipidmatrisen 7, 8 . Intercellulær heterogenitet, porøsitet av stratum corneum, dose / tidsavhengighet og lipidmatrisen motstår også intracellulær penetrasjon av NP gjennom stratum corneum 6, 9 . Denne gjennomtrengningsveien er ennå ikke klart forstått. På den annen side er det en rekke rapporter som er enige om at follikulær gjennomtrengningsvei spiller en sentral rolle i penetrasjonen av NP gjennom ikke skadet hud 6, 10, 11, 12 . For å kunne grundig undersøke disse fakta ble sfæriske, stangformede og avkortede trekantede AgNPs syntetisert, og deres hudpenetreringskapasiteter ble studert ved bruk av in vitro og in vivo cellemodeller. Her rapporterer vi for første gang om formavhengig hudinntrenging av AgNPs.

( A ) To viktigste mulige hudpenetreringsbaner er illustrert: (i) går inn via hårfollikler (follikulær gjennomtrengningsvei); og (ii) diffunderer gjennom hullene mellom corneocytter (den intercellulære penetreringsbanen). ( B ) Absorptionsspektre av oppløsninger som inneholder kjemisk syntetisert SNP, TNP og RNP, som viser forskjellige topper av absorbanse ved bestemte bølgelengder. ( C ) TEM-bilder som viser morfologi av syntetiserte AgNPs. ( D ) TEM-bilder viser tydelig den diskrete eksistensen av annerledes formede AgNP'er etter dispergering av dem i fosfatbuffer (pH 7, 0), mediet som brukes i donorfeltet i Franz-cellen. Dimensjoner av AgNPs er nesten lik den av de syntetiserte.

Full størrelse bilde

resultater

Morphologies of AgNPs

Spektrofotometrisk analyse viste forskjellige absorbansspektre for forskjellige formede AgNP'er (figur 1B) 5 . Gjennomsnittlige dimensjoner av de forskjellige formede AgNP ble bestemt fra transmisjonselektronmikroskopisk (TEM) bildeanalyse (figur 1C). Gjennomsnittlig diameter på sfæriske nanopartikler (SNPs) var 50 nm, mens gjennomsnittlig lengde og diameter av stangformede nanopartikler (RNPs) var henholdsvis 50 og 20 nm. Triangulære nanopartikler (TNPs) dukket opp som 2 nm tykk like-sidige trekantede plater med gjennomsnittlig sidelengde på 50 nm.

Kolloid stabilitet av AgNPs

Colloidal stabilitet av nanopartiklene i donorcellemediet (fosfatbuffer, pH 7, 0) av Franz-cellesystemet som ble anvendt for in vitro- analyse ble først bekreftet ved å måle zeta-potensialet av AgNP etter dispergering av dem i fosfatbuffer (pH 7, 0). De målte zeta potensialene av AgNPene dispergert i destillert vann så vel som i fosfatbuffer var alle større enn 20 mV (tabell 1) som indikerer at NPene danner stabile kolloider i fosfatbuffer (pH 7, 0) medium. Vanligvis ble NP med zeta potensialer større enn 20 mV eller mindre enn -20 mV rapportert å ha tilstrekkelig elektrostatisk avstøtning for å forbli stabil i oppløsning 13 .

Full størrelse bord

I tillegg ble dynamisk lysspredning (DLS) brukt for å måle den hydrodynamiske størrelsen av partikler og bestemme agglomereringstilstanden til nanopartikler i vann og fosfatbuffer (pH 7, 0). DLS-størrelsesdata for AgNP'ene av forskjellig størrelse i vann- og fosfatbuffer (tabell 1) var i umiddelbar nærhet som indikerte at det ikke var noen agglomerering av AgNP i Franz-celledonor-medium, dvs. fosfatbuffer.

TEM-bilder av nanopartiklene dispergert i fosfatbuffer (pH 7, 0) -medium validerte ubestemt den diskrete eksistensen av AgNPs (figur 1D) med deres dimensjoner nesten lik den for de syntetiserte segene (figur 1C).

In vitro hudpermeabilitetsstudie

In vitro permeabilitetsstudie av annerledes formede AgNPs gjennom huden ble utført ved bruk av Franz diffusjonscellesystem (figur 2A). Mengden sølv gjennomsyret gjennom hud til reseptorcelle ved forskjellige tidsintervaller ble målt ved å bruke induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) (figur 2B). De rapporterte resultatene er gjennomsnittet av data oppnådd fra tre til fem uavhengige forsøkssett. Standardavvikene var innenfor 5% av gjennomsnittsverdien. AgNPs viste formavhengig permeasjon gjennom huden; permeasjonen økte med tanke på tiden. Interessant var for RNPs og TNPs observert en lagringstid på 8 timer før sølv kunne detekteres i reseptorvæsken (figur 2B, C). Plutselig økning i hudpenetrasjonen av RNPs ble observert etter 12 timer sammenlignet med TNP og SNP (figur 2B). Etter 12 timer var mengden sølv penetrert fra RNP, SNP og TNP gjennom enhetsareal på henholdsvis 1, 82, 1, 17 og 0, 52 μg / cm2. Ved 30 timer viste TNPs den laveste penetrasjonshastigheten på 2, 47 μg / cm2; mens penetreringshastighetene for SNP og RNP ble registrert som henholdsvis 3, 05 μg / cm2 og 7, 22 μg / cm2.

( A ) Ultra-tynn museskinnseksjon (overflateareal 1, 64 cm 2, tykkelse 0, 7-1, 0 mm) ble lastet på Franz-cellesystemet. ( B ) Mushud ble utsatt for annerledes formede AgNPs i 30 timer. Mengden sølv penetrert fra AgNPs gjennom museskinn ble bestemt og plottet som en funksjon av tiden. ( C ) Antall tetthet av annerledes formede AgNPs gjennomsyret gjennom museskinn, som en funksjon av tiden i Franz diffusjonscelle (× 10 9 ). ( D ) Graf av

versus t (er) av permeabilitetsstudie ved bruk av museskinn. Forskjellige faser i permeasjonen av forskjellige formede AgNP ble identifisert, og helling av lineær pasning av de forskjellige faser av permeasjon p (t) ( t = 0 for innledende fase og 1, 2 for suksessive faser) ble anvendt for å bestemme den tilsvarende eksperimentell permeabilitet ved innledende og suksessive faser av permeasjon ( P t ) ( t = 0 for innledende fase og 1, 2 i henholdsvis suksessive faser). ( E ) Eksperimentelle og teoretiske permeabilitetskoeffisienter av forskjellig formede AgNPs (× 10 -6 ). Eksperimentelle permeabilitetskoeffisienter betegnes som ( P t ) ( t = 0 for startstadiet og 1, 2 for henholdsvis suksessive faser). Teoretisk permeabilitet er representert som P T. ( F ) Ved bruk av permeabilitetsverdiene ble eksperimentelle diffusjonskoeffisienter av AgNPs gjennom museskinn (Dt) ( t = 0 for startstadiet og 1, 2 for suksessive faser), som ble assosiert med forskjellige permeasjonsfaser, beregnet og plottet sammen med teoretisk diffusjonskoeffisienter. ( G ) Etter 30 timers eksponering for annerledes formede AgNP ble hudvevprøver utsatt for TEM-bildebehandling til lokaliteten av AgNPs (prikkede sirkler) penetrert i huden. Vevseksjoner opprettholdt god morfologi gjennom hele forsøkene. Dette ble vurdert ved forekomst av et stratum corneum (SC) lag (ca. 10-15 μm), en kompakt levedyktig epidermis (ca. 60-80 μm) og en kollagen- og muskelfylt dermis. Ingen store forskjeller ble observert i hudprøver behandlet med forskjellig formede AgNPs, bortsett fra at SC-laget ble funnet fraværende i vev behandlet med SNPs. Målestokk = 10 μm (2500 ×), 2 μm (8 000 ×), 300 nm (40 000 ×), 200 nm (50 000 ×) og 150 nm (100 000 ×).

Full størrelse bilde

Normalisering av annerledes formede AgNPs penetrert gjennom huden

For å regne for forskjellen i sølvbelastning eller tetthet av AgNPs på grunn av endring i atom / gitterjustering med form og størrelse, ble mengden av forskjellige formet NP gjennomtrengt gjennom huden normalisert med hensyn til talltetthet av forskjellige AgNPs, dvs. totalt antall av AgNPs tilstede i Franz-cellereceptorcellen i en gitt tid. Tettheten av tørkede sølvnanopartikler ble funnet å være 1, 32 g / cm3, mens den for RNP og TNP var henholdsvis 1, 51 og 10, 49 g / cm3. Sfæriske sølvnanopartikler (vanligvis med en kubokktahedisk eller flertydig dekahedral eller kvasi-sfærisk morfologi) har overveiende {100} fasetter sammen med liten prosentdel av faset med høy atomdensitet {111}, mens i tilfelle av stavlignende sølvnanopartikler (f.eks. femkantede stenger), sideflater er bundet av {100} og endene av {111} fasetter 5 . Derfor forventes sølvbelastning i RNP å være høyere enn i SNP. På den annen side er basalplanet av en avkortet trekantet nanoplat med ansikts-sentrert-kubisk gitterstruktur (fcc) en overflate med høy atomtetthet {111}. Dette resulterer i forholdsvis høy lasting av sølv i TNP som ligner tettheten av ren fcc sølv. Med tanke på SNPs, RNP og TNP som henholdsvis sfære, sylinder og planer, liksidig trekantet plate, ble volumet av en NP av hver form beregnet ved bruk av deres gjennomsnittlige dimensjoner som bestemt ved hjelp av TEM-bildeanalyse. Beregnet volum av en RNP, SNP og TNP var henholdsvis 1, 57 x 10-17, 6, 54 x 10-17 og 1, 13 x 10-17 cm3. Totalt volum av annerledes formede AgNP'er gjennomsyret ved tid t ( V t ) ble beregnet ved å dele mengden sølv gjennomsyret ved tid t (målt ved bruk av ICP-MS) fra hver form av NP med respektive tetthet ( σ ) av NPene. Antall tetthet av AgNPs, (definert som totalt antall AgNP'er tilstede i hele reseptorcellen i en gitt tid), gjennomsyret ved tidspunkt t, ble beregnet ved å dele volum av alle partikler gjennomsyret ved tid t ( Vt ) med volum av en partikkel . Antall AgNP i enhedsvolum av reseptorcellen ble ikke beregnet da reseptorvolumet kan variere avhengig av formen og størrelsen av reseptorcellen i den brukte Franz-cellen; mens det totale antall nanopartikler som gjennomsyres gjennom et gitt område av hud med gitt tykkelse på et gitt tidspunkt, vil være uavhengig av reseptorcelle dimensjoner. Antall tettheten av AgNPs med forskjellig størrelse i reseptorvæske ved forskjellige tidsintervaller er vist i figur 2C. Antall tetthet av NP i reseptorvæske økte med tiden. Selv om det var en forsinkelsestid for penetrasjon for RNP, økte dens tetthet i reseptorvæsken bratt etter 12 timer og deretter forblir alltid høyere enn antallet tetthetene i andre to former av NP. Antall SNP i reseptorvæske var alltid høyere enn TNPs. Maksimal antall tetthet av RNP var 5, 68 × 10 11 ved slutten av 30 timer. Antall tetthet av SNP og TNP i reseptorvæske etter 30 timer var henholdsvis 5, 82 x 10 10 og 3, 43 x 10 10 . Oppnådde resultater tyder tydelig på formavhengig hudinntrenging av AgNPs.

AgNP har flere permeabilitetsfaser gjennom museskinn

Figur 2D viser grafen til

versus t (i s) av in vitro permeabilitetsstudie ved bruk av museskinn, hvor Nr ( t ) betegner AgNP-tallets tetthet i reseptorvæsken ved tid t, er N o initialtalltettheten i donorcelle (ved t = 0) og

hvor V d og V r representerer volum av AgNP suspensjon i donor- og reseptorbuffere i henholdsvis donor- og reseptorceller. Hellingen av lineær passform av denne plottet ( β ) er relatert til permeabilitetskoeffisienten ( P, i cm / s) og membran (hud) overflateareal ( A, i cm 2 ) som

. Ved å analysere grafen nøye (figur 2D) ble forskjellige faser i permeasjonen av forskjellig formede AgNPs identifisert, og p (t) ( t = 0 for startstadiet og 1, 2 for suksessive faser) ble anvendt for å bestemme den tilsvarende eksperimentelle permeabilitetskoeffisienter ved første og suksessive faser av permeasjon ( P t ) ( t = 0 for startstadiet og 1, 2 for henholdsvis suksessive faser). Ved hjelp av eksperimentelle permeabilitetsverdier ble eksperimentelle diffusjonskoeffisienter av AgNPs gjennom mushud ( D t ) ( t = 0 for startstadiet og 1, 2 for suksessive faser), som ble assosiert med forskjellige faser av permeasjon, beregnet ut fra ligningen D = Pd hvor D er diffusjonskoeffisienten, og d er tykkelsen på membranen.

Teoretiske diffusjonskoeffisienter ( D T ) av AgNPene ble beregnet ved hjelp av Stokes-Einstein-ligning som betraktet vann som medium i donor- og reseptorceller. Teoretiske permeabilitetskoeffisienter ( P T ) av AgNP ble bestemt ved å bruke tilsvarende D T- verdier. For hver form av AgNP ble to faser i permeasjonen gjennom huden observert. Den første og andre permeabilitetskoeffisienten (i cm / s) av SNPs gjennom rottehud [4, 32 × 10-8 ( P 0 ) og 4, 59 × 10-8 ( P 1 )] var meget nær og indikerte ensartet gjennomtrengning av NP'ene gjennom huden. På grunn av innledende forsinketid var det ingen initial permeabilitetsfase for RNP og TNP. Til forskjell fra SNP ble imidlertid en tredje permeabilitetskoeffisient ( P2 ) oppnådd for RNP og TNP. De andre permeabilitetskoeffisientene ( P1, i cm / s) av RNP og TNP var henholdsvis 4, 75 x 10-8 og 1, 95 x 10-8 . Gjennomtrengningskoeffisienten for disse to formene av NP økte i det senere permeasjonstrinnet. For RNP var økningen med en størrelsesorden ( P2 = 2, 29 × 10-7 cm / s) mens den avledede P2- verdien for TNP var 7, 16 × 10-8 . Det er bemerkelsesverdig at permeabilitetskoeffisienten av RNPs var mye høyere enn permeabilitetskoeffisientene av andre to former av NP'er. Alle eksperimentelt oppnådde verdier av permeabilitetskoeffisienter ble funnet å være lavere enn P T (figur 2E). Diffusjonskoeffisienter ( D ) av AgNPs gjennom museskinn ble også avledet (figur 2F). I likhet med permeabilitetskoeffisienten ble det oppnådd to respektive diffusjonskoeffisienter for SNPs (D0 og D1) og to hver for RNPs og TNPs (D1 og D2). SNP viste initial diffusjonskoeffisient på ( D 0 ) 4, 3 × 10-9 cm 2 / s og sistnevnte av ( D 1 ) 4, 59 × 10-9 cm 2 / s. RNP viste diffusjonskoeffisient på (D1) 4, 8 × 10-9 cm2 / s og senere på (D2) 2, 3 × 10-8 cm2 / s, mens for TNP var D1 1, 9 × 10-9 cm2 / s og D 2 var 7, 2 x 10-9 cm 2 / s. I likhet med permeabilitetskoeffisienten ble teoretisk diffusjonskoeffisient [ D T ] avledet og sammenlignet med eksperimentelle verdier (figur 2F). Alle eksperimentelt oppnådde verdier av diffusjonskoeffisient ble funnet å være lavere enn D T som forventet.

For ytterligere å forstå den formavhengige hudpenetrasjonen av AgNPs, ble museskinnprøver fra Franz-diffusjonscellesystemet (etter 30 timers eksponering mot annerledes formede AgNPs) utsatt for TEM-bildebehandling. For hver form av AgNP ble det observert ultra tynne skårte vevseksjoner (eller rister) i vertikal retning fra hudoverflaten til indre dermale lag under TEM. Dermed var hovedmålet å bestemme penetreringsadferd (opphopning) av sølvnanopartikler som en funksjon av huddybde, dvs. å bestemme dybden av penetrasjon av forskjellige formede AgNPs. Representative TEM-bilder av grid brukt for RNPs ble vist i figur 2G. TEM visualisering på ultra-tynne skivede vevseksjoner viste at nesten alle hudbrikkene som ble brukt for penetreringsstudiene, opprettholdt god morfologi gjennom hele forsøkene. Det ble vurdert ved tilstedeværelse av et stratum corneum (SC) lag (ca. 10-15 μm), en kompakt levedyktig epidermis (ca. 60-80 μm) og en kollagen- og muskelfylt dermis (i vertikal retning fra hudoverflaten til indre dermale lag) (figur 2G). Ingen store forskjeller ble observert i hudprøver behandlet med annerledes formede AgNPs. TEM-bilder viste ikke tegn på NP-akkumulering i folliklene. TEM-analyse avslørte videre formavhengig hudpenetrasjon og akkumulering av annerledes formede AgNP i de forskjellige lagene av huden som indikerer deres penetrasjon gjennom den intercellulære banen. TNP ble detektert i SC-regionen i en dybde på ca. 10 μm mens SNPs ble observert i et levedyktig epidermalt lag i en dybde på 14, 9-19, 9 μm som viste at både TNP og SNP ikke kunne trenge gjennom det dermale-epidermale krysset i den underliggende dermale lag etter 30 timers behandling (figur 2G). På den annen side ble RNPs observert i dermellaget i en dybde på 244 um, noe som tydelig indikerte deres høy gjennomtrengningsevne gjennom det dermale-epidermale krysset (figur 2G).

In vivo hudpermeabilitetsstudie

En in vivo- studie ved bruk av SKH-1 hårløse mus (figur 3A) viste varierende hudpenetreringshastigheter av forskjellig formede AgNPs i ICP-MS analyse, da systemiske sirkulerende blodprøver ble analysert etter fem dagers behandling (figur 3B). I samsvar med in vitro- data viste RNP den høyeste konsentrasjonen i blodet 108, 57 ± 5, 43 ng / ml; mens konsentrasjonen av sølv gjennomsyret fra SNP og TNP i blod var henholdsvis 50, 00 ± 2, 50 ng / mL og 39, 29 ± 1, 96 ng / mL (figur 3B). Konsentrasjonen av sølv (gjennomsyret fra forskjellige formet NP) i blod ble normalisert med hensyn til talltetthet av forskjellige AgNP'er. I likhet med in vitro- funn ble den maksimale antall tetthet av NP i blod funnet for RNP-behandlede mus (125, 79 ± 2, 2 × 10 8 ), etterfulgt av SNP-behandlet (15, 84 ± 0, 79 × 108) og TNP-behandlet (9.08 ± 0, 45 × 108 ) mus (figur 3C).

Stangformede, sfæriske og trekantede AgNPs ble topisk påført på musens bakside som dekket et område på 2, 5 × 2, 5 cm 2 ( A ). Etter 5 dager ble mengden sølv i blodprøver oppsamlet fra deres hjerter målt ved bruk av ICP-MS, og konsentrasjonen av sølv ( B ) og talltetthet av forskjellige formede AgNPs i blod (× 10 8 ) ( C ) ble beregnet og plottet mot forskjellige former for AgNPs. Ingen signifikante endringer i atferd, helse eller behandlede hudområder ble observert hos dyrene under forsøket (data ikke vist).

Full størrelse bilde

Diskusjon

Follikulær gjennomtrengningsvei har blitt rapportert som en "ideell" rute for at NP skal trenge gjennom huden, da follikulære porene fungerer som et utmerket lagringssted og gir den korteste ruten for å komme inn i de livlige hudlagene 6, 10, 11, 12 . Disse avsatte NP'ene kan ikke fjernes ved naturlig desquamation, tekstilkontakt eller kroppsvask 6 ; Noen NP kan imidlertid fjernes ved hårvekst eller sebumproduksjon. Tidligere studier viste at metall NP 10, 11 (7-20 nm) og polystyren NP 14 (20-200 nm) kan trenge gjennom huden gjennom follikulærbanen. Honeywell-Nguyen et al. demonstrert permeabiliteten av elastisk (100-150 nm) og ikke-elastiske partikler via follikulær vei i epidermale og SC-lag, henholdsvis 12 . Imidlertid viste våre resultater tydelig formavhengig hudpenetrasjon av AgNPs gjennom forskjellige lag av hud som indikerer hudpenetrasjon av AgNPs gjennom intercellulær bane (figur 2G). Likevel vil ytterligere undersøkelser av TEM-bilder ved tidligere tidsrammer være nødvendig for å belyse disse fakta mer detaljert.

Resultater oppnådd i denne studien demonstrerer forskjellige hudpenetreringshastigheter og dybde-inntrenging av stangformede, sfæriske og trekantede AgNPs. I denne forbindelse kan follikulære gjennomtrengningsbaner ikke diskriminere hudinntrengningshastigheter av ulikformede NP, da follikkelåpningsdiameteren er for stor (26 ± 1 μm) sammenlignet med gjennomsnittlige størrelser av AgNPs (45-50 ± 10 nm). Således, hvis follikulær gjennomtrengningsvei spiller en sentral rolle i pattedyrs hudabsorpsjon, bør hastigheten på hudpenetrasjon av alle de forskjellige formede AgNPs ha vært lik, da de alle ville ha akkumulert i follikulære porene samtidig før deres absorpsjon gjennom dermis.

Selv om mus generelt har en høyere tetthet av follikler (658 ± 38 hårsekk / cm2) enn mennesker eller griser, dekker de fortsatt bare et lite område av hudens overflate, noe som kan begrense hudpenetrasjonen via follikulær gjennomtrengningsvei. Dette kan være en av grunnene til at vi har observert hudpenetrasjonen av NP i hårløse mus gjennom den intercellulære banen.

I et ekte verdensmiljø kan man derfor variere hudens gjennomtrenging av AgNPs i aktuelle applikasjoner, avhengig av hvilken del av kroppen som skal behandles, og kjønn og etnisitet i den menneskelige befolkningen, ettersom tettheten av hårsekkene varierer drastisk i alle ovennevnte forhold. Våre data antydet at den intercellulære gjennomtrengningsveien, og ikke den follikulære gjennomtrengningsveien, kan ha spilt en sentral rolle i den formavhengige penetrasjonen av AgNPs gjennom lipidmatrisen mellom corneocytter.

In vivo resultater viste penetrasjon av AgNP i blodkarillærer; mens in vitro- analyse viste hudpenetrasjon av stangformet, sfærisk og trekantet AgNPs til henholdsvis dermal, epidermal og SC-laget. Disse ulikheter kan forklares av eksponeringsperioden tatt for in vitro (30 timer) og in vivo (fem dager) analyse. I in vivo- analysen kan en lang eksponeringsperiode på fem dager ha gitt tilstrekkelig tid til AgNPs å sakte trenge gjennom SC, epidermal og dermale lag av hud og komme inn i blodsirkulasjonssystemet. I tillegg kan AgNPs i in vivo- analysen ha fått en ytterligere fordel av de faktiske fysiologiske forhold, da membranporestørrelsen kan variere på grunn av kroppsbevegelser, strekk, temperaturvariasjoner, innebygd blodtrykk etc.

Hudpenetrering og dybde-gjennomtrengning spiller viktige roller for å bestemme terapeutisk potensial for aktuelle midler og deres systemiske toksisitet 15 . Hudpenetasjonsforsterkere har blitt rutinemessig brukt i transdermale legemiddelformuleringer, slik at NP kan passere gjennom SC (inneholdende dehydrert matrise / døde keratinocytter innebygd i lipidmatrix ), epidermale og kollagen / muskelfylte dermale lag 8, 16 . Samtidig har imidlertid også sikkerhetsevalueringsspørsmål blitt vurdert, da NP som kommer inn i de dypere delene av huden (dermale lag), kan komme inn i blodsirkulasjonssystemet 17, 18 . I denne forbindelse kan akkumulering av AgNP i de dypere seksjoner av huden forårsake alvorlige systemiske toksiske effekter. Sølv i seg selv er ikke giftig for mennesker innenfor referansedosen [dvs. oral referansedosis ( Rf D ) = 5 × 10 -3 mg / kg-dag] 19 . Overforbruk av sølv kan imidlertid føre til argyria, noe som resulterer i permanent blågrå pigmentering av hud, øyne og slimhinner 20, 21 . I tillegg kan AgNPs forbedre effekten av å transportere giftige sølvioner til målrettede steder i menneskekroppen.

Systemisk toksisitet kan skyldes rask akkumulering av NP ved kapillær / lymfatiske kryss i dermellaget 22, membranporer / legand-mediert endocytose og fysisk brudd på lekkende endotel 23 . Raskt penetrerende NP kan omgå makrofagmedierte immunologiske responser og kan komme inn i blodsirkulasjonssystemet 24 . I motsetning til dette gir langsom penetrasjon bedre effektivitet av NP mot de infiserte cellene og gir tilstrekkelig tid for kroppens immunsystem til å avgifte NP gjennom phatocytose.

Våre resultater demonstrerte de høyeste penetrasjonsegenskapene til RNPs og deres akkumulering i hudlaget. Dette foreslo muligheten for systemisk toksisitet og uønskede kosmetiske bivirkninger, slik som argyria ved akkumulering av sølvioner i kroppen 25, 26 . Den langsomme gjennomtrengningsevnen til TNP, sammenlignet med RNP og SNP, kan skyldes tilstedeværelsen av toppbaseplanet med overordnede {111} fasetter i TNP, sammenlignet med overordnede {100} fasetter i RNP og SNPs 5 . Tidligere rapporter demonstrerte den høyeste grad av bakteriedrepende aktivitet av sølv TNP mot gram-negative bakterier E. coli 5, 27, 28 . Med tanke på den langsomme gjennomtrengningsevnen og formavhengige bakteriedrepende aktiviteten til AgNPs, kunne trekantige NP'er være en ideell kandidat for aktuelle applikasjoner, sammenlignet med stav-spahed og sfæriske AgNPs. Sølv TNP, på grunn av deres langsomt penetreringsevne, kan redusere systemisk toksisitet og øke antibakteriell effekt ved lavere doseringsnivåer 5 . Fremtidige undersøkelser av optimalisering av formavhengige doser og tidsrammer for eksponering av AgNP i forskjellige dyremodeller kan lette bedre forståelse av systemisk toksisitet indusert av AgNPs. Selv om NP er mest foretrukket for sitt store overflateareal, bør litenhet ikke være et kjernemål, da de fysikalisk-kjemiske egenskapene til NP kan utnyttes effektivt i aktuelle antimikrobielle formuleringer. Vi håper at vår proof-of-concept-studie om formavhengig hudpenetrasjon og bakteriedrepende tiltak kunne lette et nytt paradigme for å forstå NP mens du utvikler en ideell antimikrobiell transdermal medisinformulering. Videre kan dette proof of concept også brukes til å karakterisere andre metalliske nanopartikler som har formavhengig terapeutisk effekt av potensiell interesse.

metoder

Syntese av AgNPs

Frøoppløsning inneholdende 4-5 nm sølvnanopartikler ble fremstilt ved å redusere 1 ml 10 mM AgNO3 med 1 ml 100 mM NaBH4 i nærvær av 1 ml 10 mM natriumcitrat og 36 ml fersk deionisert vann. Frøoppløsningen ble alderen i 2-4 timer før den ble brukt til å fremstille nanopartikler av større størrelse.

Vekstløsninger (A, B og C) ble fremstilt for det frømidlede vekststrinnet. I utgangspunktet inneholdt to løsninger (A og B) 0, 25 ml 10 mM AgNO 3, 0, 05 ml 100 mM NaOH, 0, 05 ml 100 mM ascorbinsyre og 9 ml av en 0, 075 M CTAB-løsning. Oppløsningen C inneholdt 2, 5 ml 10 mM AgNO3, 0, 50 ml 100 mM NaOH, 0, 50 ml 100 mM askorbinsyre og 9 ml CTAB-oppløsningen.

En større nanopartikkel ble fremstilt ved å tilsette 1 ml frøoppløsning til veksleløsning A. Etter 5 minutter ble deretter 1 ml resulterende oppløsning A tilsatt til oppløsning B. Igjen etter 5 minutter ble all den resulterende løsning B tilsatt til vekstløsning C. Etter tilsetning av løsning B ble oppløsning C langsomt gul da tiden gikk videre. Den resulterende oppløsningen ble sentrifugert ved 8000 rpm i 20 minutter for å fjerne overskytende CTAB. De oppnådde sølvnanospherene ble re-dispergert i deionisert vann. Sølv nanosfærene hadde en gjennomsnittlig diameter på 40-50 nm.

Avkortede trekantede AgNP'er ble syntetisert ved en løsningsfase-metode for storskala fremstilling av trunkerte trekantede NP'er. Til partikkelvekstoppløsningen (5 ml 0, 01 M AgNO 3, 10 ml 0, 1 M askorbinsyre, 146 ml 0, 1 M CTAB og 5 ml sølvfrø) ble 1 ml 1 M NaOH tilsatt for å akselerere partikkelvekst. Fargen på løsningen endret fra lysegul til brun, rød og grønn i løpet av få minutter. Oppløsningen ble alderen ved 21 ° C i 12 timer, 35 ° C i 5 minutter og 21 ° C i 24 timer. Fargen på den eldre løsningen endret fra grønt til rødt. NP'ene ble sentrifugert ved 2100 x g i 10 minutter, og supernatanten ble oppsamlet. Pelleten ble deretter oppløst i vann, sentrifugert igjen ved 755 x g i 10 minutter, og supernatanten ble oppsamlet. De oppsamlede supernatanter inneholdt de avkortede trekantede NP.

Stangformede AgNP'er ble syntetisert ved først å fremstille en 4 nm frøoppløsning (en 20 ml løsning med en sluttkonsentrasjon på 0, 25 mM AgNO 3 og 0, 25 mM trinatriumcitrat i vann) 2 timer før syntesen. En oppløsning av 10 mM NaBH4 (0, 6 ml) ble tilsatt alt på en gang under kraftig omrøring i 30 sekunder. En oppløsning inneholdende 0, 25 ml 10 mM AgNO3, 0, 5 ml 100 mM askorbinsyre og 10 ml 80 mM CTAB ble fremstilt, etterfulgt av tilsetning av 0, 06 ml 4 nm frøoppløsning. Til slutt ble 0, 01 ml 1 M NaOH tilsatt og forsiktig ristet akkurat nok til å blande NaOH med resten av løsningen for å øke utbyttet av stavformede NP'er. Innen 1-10 min ble fargen på løsningen endret fra rød til brun, og deretter til grønn. Oppløsningen inneholdt en blanding av stav- og sfærisk formede NP'er. De stavformede NP'ene ble samlet ved sentrifugering ved 514 x g i 6 minutter, og pelleten ble resuspendert i vann.

De resulterende konsentrasjoner av syntetiserte AgNP ble målt ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) (ELAN 6100; Perkin-Elmer SCIEX). I tillegg ble de syntetiserte NP karakterisert ved UV-synlig spektroskopi og energi-filtrerende transmisjonselektronmikroskop (EFTEM) (LIBRA 120, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Prøvene for TEM-bildebehandling ble fremstilt ved å plassere en dråpe homogen suspensjon på kobbergitteret med en lakkert karbonfilm og fikk tørke i luft. Gjennomsnittlig partikkelstørrelse ble analysert fra de digitaliserte bildene med Image Tool-programvaren. UV-synlige absorpsjonsspekter ble registrert med et Optizen 2120 UV-synlig spektrofotometer (Mecasys, Daejeon, Republikken Korea) med en 1 cm kvartscelle.

In vitro hudpermeabilitetsstudie av AgNPs ved bruk av et Franz cellekammer

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Laboratory Animal Committee av Seoul National University (Animal Ethical Approval Protocol nr. SNU-121016-2). Hudprøver fra 7 uker gamle SKH-1 hårløse hanmus med en vekt på 30-35 g hver (kjøpt fra Orient Bio Inc., Seoul, Republikken Korea) ble brukt i studien. En dag før penetreringsstudien ble musen euthanisert med CO 2 -gass, og en abdominal hudprøve ble skåret ut med en elektrisk klipper og en barbermaskin. Special care was taken during the excision procedure so that the subcutaneous fat and tissues would not be damaged. The excised skin of the euthanized mouse was mounted in the Franz cell chamber (PermeGear; Hellertown, PA, USA) with epidermis facing the donor phase and placed between the donor and receptor phases to assess the transport of NPs that had penetrated through the skin at each time point. The surface contact area of the receptor phase with the tissue sample was approximately 1.64 cm 2 . For the receptor phase, 8 mL of receptor fluid buffer (2.38 g Na 2 HPO 4, 0.19 g KH 2 PO 4, and 9 g NaCl in 1000 mL of distilled water at pH 7.35) was used and maintained at 37 ± 0.5 °C, while stirring with a magnetic stirrer. Approximately 500 μL of donor fluid (phosphate buffer at pH 7.0) containing the presynthesized-NPs was added into the donor chamber. Sample (300 μl) from the receptor chamber was collected at different time interval (0, 4, 8, 12, 20, 24 and 30 h). After the collection of sample, 300 μL of fresh receptor buffer was added into the receptor chamber. Each collected sample was diluted with 4 mL of 2% nitric acid solution, and the amount of silver that penetrated through the skin was determined using ICP-MS (ELAN 6100, Perkin-Elmer SCIEX).

EFTEM imaging of skin samples

After the analysis with the Franz cell chamber, each of the skin tissue samples was sliced into 1 × 1 × 3 mM. The sliced tissues were incubated at 0–4 °C for 2 h in a fixation buffer (2% glutaraldehyde) and washed with a cacodylate buffer three times at10–20 min intervals. The tissues were fixed again with 1% osmium tetroxide (OsO 4 ) at 0–4 °C for 1–2 h, washed with a cadodylate buffer three times at 10–20 min intervals, and then stained with 0.5% uranyl acetate overnight. After overnight staining, the tissues were washed twice with distilled water and dehydrated with various concentrations of ethanol (10 min incubation each in a sequential manner in the following order: 30%, 50%, 70%, 80%, and 90% and three times in 100% ethanol). All of the excess ethanol was removed by centrifugation, and fresh ethanol was added to the tissues. The dehydrated tissues underwent a transition process by treating twice with 100% propylene oxide at room temperature for 15 min. The samples were incubated in a mixed solution (Spurr's resin and propylene oxide in 1:1 ratio) at room temperature for 2 h on an agitator, followed by removing the supernatant by centrifugation and incubation in 2 mL of 100% Spurr's resin overnight. The supernatant was removed by centrifugation and incubated in 2 mL of Spurr's resin for 2 h for the embedment and infiltration of tissues. The embedded tissues were added into the resin solution and incubated at 70 °C for 24 h to be polymerized into a resin block. The synthesized resin block was fine-trimmed and sliced into ultra-thin sections (60–90 nm) with a diamond knife. The sections were mounted onto a formvar-coated grid and double stained with 2% uranyl acetate (65 °C for 45 min) and lead citrate (room temperature for 30 min). The prepared tissue sections were analyzed by EFTEM with the setting at 80–120 kV.

In vivo skin permeability study of AgNPs

All animal experiments were performed according to the National Institutes of Health guidelines and were approved by the Laboratory Animal Committee of the Seoul National University (Animal Ethical Approval Protocol No. SNU-121016-2). SKH-1 hairless mice (7-weeks old, male) weighing 30–35 g each were used. For each shape of nanoparticles three mice were used. Anaesthetization was done by first mixing 20 mg/mL of Rompun (Baeyer Korea Co., Seoul, Republic of Korea) and 125 mg/mL of Zoletil 50 (Virbac Lab., Carros, France) in 2:3 ratio, washing with PBS and injecting into a leg muscle of the mouse. Prior to topical treatment of AgNPs to the mouse, CTAB-coated AgNPs (1.5 mL of phosphate buffer at pH 7.0 containing 36 μg of silver) were evenly applied onto a piece of gauze with a surface area of 2.5 cm 2 . The gauze containing AgNPs was placed onto the back of an anaesthetized mouse. A waterproof bandage was applied on top of the gauze and fastened by wrapping tape around the bandage. After five days of treatment, the treated mice were sacrificed, and 5 mL of blood was taken from their hearts. The concentration of silver NPs in blood samples were analyzed using ICP-MS. Each of 700 μL of blood samples were added into 3 mL of ≥90.0% HNO 3 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) and evaporated to dryness. The mass was redissolved in 3 mL of 60% HNO 3 and was again evaporated nearly to dryness. This step was repeated thrice and finally the residue was re-suspended in 5 mL of 2% HNO 3 and subjected to ICP-MS analysis.

Calculation of permeability, diffusion coefficient and number density of AgNPs

From Fick's law of steady state diffusion the following relations can be obtained for the present study:

og

where V d and V r represent volume of AgNP suspension in donor and receptor buffers in the donor and receptor phases, respectively. The subscripts d and r indicate donor and receptor phase, respectively. N d ( t ) and N r ( t ) denote AgNP number density in the respective phases at time t . Permeability coefficient (expressed in cm/s) and membrane (skin) surface area (expressed in cm 2 ), are denoted by P and A, respectively.

At time t = 0,

N r ( t ) = 0 and let us assume that

Thus at t = 0

Neglecting the very low concentration of AgNPs inside the membrane the above Eq. (3) can be rearranged as:

Putting Eq. (3) in Eq. (1), we get

og

hvor

Thus, a plot of

versus t (expressed in s) would be a linear one with a slope of β. Experimental permeability of the AgNPs were calculated from the slope of the linear line obtained by plotting

versus t plot as shown in Fig. 2D.

By carefully analyzing the graph, different phases in the permeation of differently shaped AgNPs were identified and for each phase the slope ( β ) was determined. Using different β values corresponding permeability coefficient values of each phase was derived. The permeability coefficient of the initial permeability phase was denoted by P 0, whereas the permeability coefficients of the successive permeability phases were represented by P 1, P 2 etc.

Experimental diffusion coefficients of AgNPs through mouse skin associated with different phases of permeation ( D 0, D 1, D 2 etc) were calculated using the corresponding permeability values in the following equation:

where D is the diffusion coefficient, d is the thickness of the membrane.

Theoretical diffusion coefficient ( D T ) was calculated using Stokes–Einstein equation:

where κ is the Boltzmann's constant (1.3807 × 10 16 cm 2 gs −2 K −1 ), T is absolute temperature, η is the viscosity of the medium and R is the radius of spherical AgNPs.

For calculating the diffusion coefficients of non-spherical NPs like rod shaped and triangular NPs, corrections were made using a radius value ( R 0 ) where R 0 is defined as the radius of a sphere that has a volume equal to the volume of the non-spherical entity.

Theoretical permeability coefficient [ P T ] was calculated by putting D T value in Eq. 11.

Volume of one spherical, rod-shaped and triangular NP was calculated from the following equations:

hvor

,

, og

are the volume of one spherical, one rod-shaped and one triangular NP, respectively. R is the radius of the spherical NPs. L is the length and r is the radius of the rod-shaped NPs, while a is the side length of the equilateral triangular NPs and h is the thickness of the particle.

Total volume of differently shaped AgNPs permeated at time t ( V t ) was calculated by dividing amount of nanoparticles permeated at time t (measured using ICP-MS) with respective density ( σ ) of the nanoparticles. Further, number density of AgNPs permeated at time t was calculated by dividing total volume of all particles permeated ( V t ) at time t with volume of one particle.

Tilleggsinformasjon

How to cite this article : Tak, YK et al. Shape-Dependent Skin Penetration of Silver Nanoparticles: Does It Really Matter? Sci. Rep. 5, 16908; doi: 10.1038/srep16908 (2015).

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens