Anonim

Temaer

  • biokjemi
  • Strukturell biologi

Abstrakt

Botulinum-neurotoksintypen D er en av syv svært potente toksiner produsert av Clostridium botulinum som hemmer nevrotransmisjon ved kolinergiske nerveterminaler. Et funksjonelt fragment avledet fra toksinet, LHn, bestående av katalytiske og translokasjonsdomener, er blitt utpekt som en plattform for utvikling av målrettede sekresjonsinhibitorer. Disse sekresjonshemmere er rettet mot retargeting av toksinet mot en bestemt celletype for å hemme vesikulær sekresjon. Her rapporterer vi krystallstrukturer av LHn fra serotype D til 2, 3 Å, og den for SXN101959 ved 3, 1 Å oppløsning. SXN101959, et derivat som kombinerer LHn fra serotype D med et fragment av veksthormonfrigivende hormon, har tidligere avslørt lovende resultater for å hemme veksthormonfrigivelse i hypofysetomatotrofer. Disse strukturene gir for første gang innsikt i translokasjonsdomenets interaksjon med det katalytiske domenet i serotype D. Videre sammenlignes strukturinformasjon fra litenvinkels røntgenspredning av LHn / D mellom serotyper A, B og D. Talt sammen, viser disse resultatene robustheten av "LHn-folden" på tvers av serotyper og dens bruk i konstruksjon av ekstra polypeptidkomponenter med tilleggsfunksjonalitet. Vår studie demonstrerer egnetheten til botulinum nevrotoksin, og spesielt serotype D, som grunnlag for konstruksjon av nye sekresjonshemmere.

Introduksjon

Toksiner fra Clostridium botulinum- arter er forårsaker av den sjeldne nevrologiske sykdommen botulisme. Syv forskjellige serotyper (A-G) av botulinumneuroksiner (BoNTs) påvirker mennesker og andre arter i varierende grad. En gang inne i nevroncellen blokkerer BoNTs frigivelsen av nevrotransmittere som fører til lammelse 1 . Selv om de er svært giftige, er forskjellige BoNT'er kommersielt tilgjengelige som terapeutiske midler 2 .

BoNT'er syntetiseres som en enkelt polypeptidkjede (150 kDa), som spaltes etter translasjon i et di-kjede-molekyl bestående av lettkjede (LC, 50 kDa) og tungkjede (HC, 100 kDa). LC er det katalytiske domenet og en sinkendopeptidase, mens HC videre deles i to underdomener med lik molekylær masse kalt translokasjonsdomene (Hn) og membranbindingsdomene (Hc). Ved binding til nerve terminaler blir BoNT endocytosed i en vesikkel, hvor det sure miljøet forårsaker noen konformasjonsendringer som tillater LC å gå inn i cytosol 3 . Inhibering av nevrotransmisjon foregår ved proteolyse av et av SNARE-proteinene 1 som medierer celleutspresjon 4 .

Av de syv typer botulinumtoksin er A, B, E og F kjent for å forårsake sykdommen hos mennesker, mens C og D kun er observert i dyresaker. Nærmere bestemt har D vært ansvarlig for flere nylig utbrudd av botulisme hos storfe 5 . Dette har økt interesse for denne serotypen og forstått sin presise virkemekanisme. Ingen tilfeller av type D human botulisme har noen gang blitt registrert. Coffield et al . 6 undersøkte virkningen av serotype D på humant vev og viste dets manglende evne til å blokkere nevromuskulær overføring når den ble testet på et nivå 10 ganger høyere enn for serotype A. Denne begrensede aktiviteten ble nylig bekreftet in vivo ved elektrofysiologisk undersøkelse på humane muskler 7 og kan være knyttet til forskjeller i reseptorbindende domene 8, 9 . BoNT / D virker imidlertid på samme måte som de andre botulinumneurotoksinene ved å målrette mot en av de intracellulære SNARE-proteiner. Synaptobrevin (eller VAMP) ble identifisert som det BoNT / D-spesifikke substratet 10 og spaltes ved Lys59-Leu60-stillingen.

BoNT / A og / B er for øyeblikket de eneste serotyper som er godkjent for medisinsk bruk. Med fremveksten av immunreaktivitet og resistens hos pasienter 11 kan andre serotyper som BoNT / D gi et nyttig alternativ. Den vellykkede retargeting av BoNT-aktivitet for terapeutiske formål, ved forening av LHn-fragmentet (katalytiske og translokasjonsdomener) med forskjellige ligander, er beskrevet 12 . Spesielt ble en målrettet sekresjonshemmer (TSI) kombinert med et hormonavgivende hormon (GHRH) reseptormålingsdomene med LHn / D-fragmentet, kalt qGHRH-LHn / D, spesielt å hemme hypofysetomatotrop veksthormonfrigivelse 13 . Dette molekylet viste effektiv intracellulær aktivitet på VAMP-3 i rottepituicytter og dermed oppmuntrende potensial i behandlingen av Acromegaly 14 . Det siste LHn / D-derivatet, SXN101959, som kombinerer det funksjonelle BoNT-fragmentet med et GHRH-liganddomen [qGHRH (1-40)], presenterte kraftig og reversibel hemmende virkning på den somatotropiske akse, og slike funksjoner er godt justert med behandling av overproduksjon av vekst hormon 15 . Arrangementet av de funksjonelle domener innenfor SXN101959 innebærer en ny orientering hvor GHRH-liganden ligger sentralt mellom LC og HC i enkeltkjedepolypeptidet uttrykt i E. coli og med et proteasespaltningssted lokalisert mellom GHRH-liganden og LC, slik at følgende proteaseaktivering for å generere den aktive di-kjede-TSI-GHRH-liganden er ved aminoterminalen til HC-domenet. Dette arrangement, betegnet sentralt presentasjon, ble nødvendig ved kravet til GHRH-liganden for å ha en fri N-terminus for å kunne binde og aktivere dens reseptor. Det betyr imidlertid at det relative arrangementet av bindingsdomene i forhold til LC- og Hn-domenene er forskjellig fra det i BoNT og tidligere rapporterte TSI-proteiner 16 . Det resulterende TSI-proteinet er funksjonelt med hensyn til binding av dets reseptor, internalisering i cytosol av målceller, spalting av substrat SNARE-proteinet og inhibering av veksthormonsekresjon 14, 15 . Konsekvensen av denne nye domenearrangement på strukturen av TSI-proteinet er imidlertid ikke kjent.

Strukturell og biokjemisk karakterisering av LHn-fragmentene fra serotyper A og B 17, 18 har gitt et molekylært grunnlag for deres funksjonalitet, som representerer et viktig skritt fremover for utformingen av nye molekyler basert på disse rammene. For å vurdere dets anvendelighet for ytterligere farmasøytisk utvikling ble strukturen av LHn / D analysert ved røntgenkrystallografi (fast krystallinsk tilstand) og liten vinkel røntgen-spredning (SAXS, i løsningsmodus). Røntgenkrystallstrukturen viste nøkkelelementer av BoNT / D, inkludert fleksibiliteten til translokasjonsdomenet og den forseggjorte interaksjonen med sin katalytiske partner. SAXS-analysen bekrefter relevansen av krystallstrukturene og stabiliteten til LHn-malen i løsning. Røntgenkrystallstrukturen av SXN101959 ved 3.1 Å bekreftet videre stivheten av LHn / D's strukturelle ramme og dets evne til å imøtekomme nye arrangementer av domenesubunitene, slik som sentral presentasjon, selv om GHRH-ligand-domenet ikke var synlig. Denne studien skal således gi det strukturelle grunnlaget for utviklingen av BoNT / D-basert målrettet sekretorisk inhibitor (TSI) som kan vise seg nyttig i behandlingen av hypersekretoriske lidelser.

Resultater og diskusjon

Struktur av LHn / D

Dette er en mutant endo-negativ form av LHn / D hvor det katalytiske domene er inaktivert ved en substitusjon av to aminosyrer i sinkbindingsstedet (H233Y, E230Q). Krystallet av LHn / D diffradert ved 2, 3 Å oppløsning i romgruppen P 6 4 22 med celle dimensjoner a = b = 173, c = 222 Å; a = p = 90, y = 120 ° (tabell 1). Til tross for den store enhetscellen var et enkelt molekyl til stede i den asymmetriske enheten som tilsvarer et uvanlig høyt løsningsmiddelinnhold på 75%. Røntgenkrystallstrukturen presenterer de to domenene, LC og Hn, i nært samspill. Ingen elektrondensitet ble observert for regioner 442-457 (mellom de to domenene), residuene 494-510 og den C-terminale polyhistidin-merket (siste femten rester), alle i løsningsmiddel-tilgjengelige områder (figur 1).

Full størrelse bord

Ribbon diagram representasjon av LHn / D struktur, LC i cyan, belte regionen i grått og Hn i blått. C-terminalen til LC og N-terminalen til Hn er merket henholdsvis med en cyan og grå stjerne. Den uordnede regionen av beltet er presentert som en grå-strekket linje. Disulfidbindingen mellom LC og Hn er uthevet i oransje.

Full størrelse bilde

LHn / D deler 34 til 35% identitet med det tilsvarende fragmentet av BoNT / A, / B og / E, for hvilke strukturer i full lengde er tilgjengelige 19, 20, 21 . LHn / D presenterer en lignende samlet fold som tidligere observert for LHn / A og / B 17, 18 . Translokasjonsdomenet til serotype D er vist for første gang og inkluderer to lange spiral-spiralhelger med ytterligere korte spiralformede segmenter på begge sider. Det katalytiske domenet har den kuleformede fold som er typisk for andre lette kjeder, men viser viktige forskjeller i fleksible sløyfeområder. I tillegg er en av de mest spennende egenskapene til BoNT, belteområdet (residual 458-547), som er en del av Hn og omgir LC, synlig i elektrondensitetskartet (til tross for høyt løsningsmiddelinnhold i krystallet) i struktur presentert her og fremhever de intrikate samspillet mellom de to domenene. En PISA 22- analyse viser at LC-båndets interaksjon støttes av over 40 potensielle hydrogenbindinger og 2 saltbroer, og utgjør et kontaktområde på 3373 Å 2 . I tillegg produserer LC og Hn (unntatt belte) et ytterligere 1392 Å 2 begravd grensesnittområde som hovedsakelig involverer hydrofobiske interaksjoner.

Den lette kjeden

Strukturen av den katalytisk inaktive mutant lettkjede overlapper godt med høyoppløsningsstrukturen av en rekombinant form som tidligere er rapportert (PDB-kode 2FPQ 23 ) med en rotmiddelverdig kvadratfeil (rmsd) på 2, 3 Å (over 411 Ca-atomer; Fig. 2 ). Tap av sink-ionet ble bekreftet ved en lokal omplassering av de resterende aktive rester (figur 2B, C). Mutasjon av sinkkoordinerende H233 til tyrosin forårsaket forskyvning av katalytisk ion, erstattet i sin posisjon med Y233-hydroksylgruppen. Samlet sett virker zinkionens rolle for det meste katalytisk med lite innvirkning på den strukturelle integriteten til den lette kjeden.

( A ) Ribbon diagram representasjon av LHn / D struktur med sin lette kjede i cyan, belte regionen i grått og translokasjons domene i blått. PDB 2FPQ 23 er vist i gult med sinkjon som en grå sfære. ( B ) Residuer av katalytisk lomme av LHn / D er vist med pinner for å markere effekten av den dobbelte mutasjonen E230Q og H233Y. 2Fo-Fc- elektrondensitetskortet motsatt på 1σ-nivå er vist i blått. ( C ) Residuer av katalytisk lomme av LC / D som presenterer det klassiske sinkkoordinasjonsmotivet HEXXH. ( D ) og ( E ) Nærbilder av henholdsvis løkke 250 og 210. Residenter involvert i loop-interaksjoner er vist i pinner og merket.

Full størrelse bilde

2FPQ 23- strukturen (heretter referert til som "2FPQ") tilsvarer rester 1-424 av den lette kjede og omfatter således ikke noen av elementene som interagerer med resten av toksinet. I denne strukturen vises residualene 166-170 av den katalytiske kanalen i to mulige konformasjoner, den ene er en tilfeldig spole nær sinkatomet og den andre en kort p-streng som fullfører den katalytiske lommen. Videre var residiene 173-179 uordnet. Den foreliggende LHn / D-strukturen var derimot stabil over tverrene 166 til 179 hvor segmentene 168-172 og 178-184 tok på et a-spiralformet arrangement (figur 2D). De flere konformasjoner av dette området over krystallstrukturene, i nærheten av det aktive stedet, indikerer en grad av fleksibilitet som kan gi nødvendig plass til substratinteraksjon 24 .

De mest merkbare forskjellene mellom den nye strukturen og 2FPQ ligger i fleksible sløyfeområder, spesielt de i grensesnittet med translokasjonsdomenet. For eksempel presenterer sløyfe 63-70, som er overflate tilgjengelig i 2FPQ, fremdeles en tilfeldig spole i LHn / D, men stabiliseres av den utvidede karboksylterminale enden av LC (rester 429-431) på den ene siden (S70) og ved enden av beltet (F539) på den andre (R63) (Fig. 2D). I tillegg er sløyfe 250, som presenterer lavsekvensidentitet med andre lette kjeder 23, men er synlig i 2FPQ, vedtar en annen konformasjon i LHn / D med en 10 Å og 25 ° bevegelse (figur 2D). Sløyfen stabiliseres gjennom hydrofobiske interaksjoner som involverer rester 256-258 (GFF) med Hn, og potensielle elektrostatiske interaksjoner av rester Q260-D261 med beltet som utelukker den katalytiske lommen. Et tredje område av interesse er den fleksible sløyfen i posisjonene 205-217, som var fullstendig forstyrret i 2FPQ og er synlig i LHn / D. Den hydrofobiske delen av sløyfen (V205-T206) passer i den aromatiske lommen sammensatt av Y731 og Y734 av en av de lange Hn-helixene, mens ryggraden av rester 212-214 stabiliseres ved hydrofobe interaksjoner med den andre helixen (V776-S779 ) (Figur 2E). Selv om krystallpakning kan påvirke noen av disse interaksjonene, kan de observerte endringene delvis tilskrives det komplekse grensesnittet mellom de to domenene sammenlignet med strukturen av den enkle lette kjeden (i 2FPQ).

Samspillet mellom det katalytiske domene og dets VAMP-substrat innebærer flere bindingssteder basert på informasjonen gitt av strukturen av LC / F med et VAMP-inhibitorkompleks 25 og nylig mutagenesearbeid 24 . Flere underområder av katalytisk lomme av LC / D har vist seg å være essensielle for substratbinding. Interessant, LHn / D-strukturen fremhever plastikkheten av LC innenfor konteksten av hele toksinet på disse spesielle stedene. For eksempel presenterer R372 av S2 '(figur 2D) en dobbelt konformasjon, men forventes å danne en hydrogenbinding med P2'-stedet for VAMP. I tillegg tilveiebringer den hydrofobe S1'-lommen og S3-sløyfen i katalytisk domene i LHn / D nye alternative konformasjoner som ble vist å forårsake minst 50 ganger tap av katalytisk aktivitet når de muteres til henholdsvis Y168A / L200D og R63A (Fig. .2D) 24 .

Det lange substratkravet for alle BoNT-serotyper er atypisk til andre sinkproteaser og involverer flere bindingssteder distalt fra katalytisk lomme 26 . Guo og Chen identifiserte og merket disse eksosittene B1 til B5 i LC / D 24 . Ingen av disse nettstedene presenterer noen konformasjonsendringer i LHn / D. Mens B1 er begravet i LC, 15 Å vekk fra det aktive stedet, viser de hydrofobe flekkene B4 til B5 omfanget av substratgenkjenning på den tilgjengelige overflaten av den frie lette kjeden. I LHn / D er disse lommene i samspill med beltet (figur 3) og innebærer en potensiell substrathemmende rolle for denne regionen, som også hypoteset for BoNT / A og / B 27 .

( A ) Krystallstruktur av LHn / D med belteområdet representert med gråpinner. Resten av translokasjonsdomenet er vist i blått, den lette kjeden er vist som en cyanoverflate. Strukturen av LC / F i kompleks med en VAMP-peptidinhibitor (PDB 3FIE 25 ) ble overført til LHn / D og VAMP er representert som et rosa bånd. ( B) Superposisjon av belteområder av LHn / A (PDB 2W2D 17 ), / B (PDB 2XHL 18 ), / D og BoNT / E (PDB 3FFZ 21 ), henholdsvis i blå, magenta, cyan og grå. Amino- og karboksylenden av beltet er merket.

Full størrelse bilde

Det translokasjonsdomenet og beltet

Det katalytiske domenet er normalt koblet til translokasjonsdomenet gjennom en enkelt disulfidbro etter aktivering av BoNT i et di-kjede-molekyl. Selv om konstruksjonen som ble benyttet for krystallisasjonsforsøk, ikke var aktivert, var rester 442-457, som var tilsvarende det konstruerte spaltningsstedet og fleksibel linker mellom de to domener, ikke synlige. Cysteinbroen stabiliseres imidlertid ved dannelse av en liten p-ark mellom C-terminalen til LC, N-terminalen til Hn og enden av beltesegmentet (figur 1).

Belteområdet i / D er generelt lik de tilsvarende segmentene i serotyper / A, / B og / E (figur 3). Den omgir LC etter en hydrofob spore langs overflaten. Interessant nok har beltet i de andre kjente BoNT-strukturer blitt observert i sin helhet og tar et konservert a-spiralformet arrangement i en stilling hvor LC / A ble vist å binde sitt substrat (SNAP-25) i en lignende sekundær konformasjon 21, 26 . I LHn / D mangler sytten aminosyrer i dette området helt (rester 494-510), som indikerer en fleksibel sløyfegruppe som ikke er i stand til å interagere med LC / D. Bemerkelsesverdig er LC / D kjent for å gjenkjenne et kortere substrat enn dets motstykker 28, og dette nettstedet forventes derfor ikke å spille en rolle i VAMP-binding. Den fulde funksjonen av beltegruppen i BoNT er ennå ikke fullstendig forstått, men bevis tyder på en mulig rolle utover beskyttelse av LC, og mot en chaperone-lignende mekanisme for translokasjon og membraninnsetting 27, 29 .

Hovedkomponentene i translokasjonsdomenet er de to spiral-spiralhelkene på ca. 105 Å (figur 1). Mens den sekundære a-spiralformede strukturen er konservert over serotyper, har de to helikene alle et sentralt bøyepunkt som kurver i forskjellige grader (figur 4). Av de fire serotyper (med kjente Hn-strukturer så langt), ser D ut den retteste. Det skal også legges merke til at Hn / D presenterte særlig høy B-faktor ved ekstremiteter av disse helikene (figur 5D), med svak elektrondensitet for den tilfeldig spiralformede sløyfen som forbinder dem. Dette er sannsynligvis en indikasjon på fleksibilitet innenfor disse regionene. De mindre skruene som flankerer hovedrammen er også godt bevart og på samme måte plassert over serotyper. I tillegg danner den synlige C-terminale en liten a-helix som er involvert i krystallpakning med et symmetri-relatert molekyl og vises i en annen orientering til det tilsvarende segmentet i LHn / A og / B.

Superposisjon av translokasjonsdomenene (uten belte) av henholdsvis LHn / A, / B, / D og BoNT / E, i henholdsvis blått, magenta, cyan og grått bånd. Amino- og karboksylenden av domenet er merket.

Full størrelse bilde

( A ) Krystallstrukturen av SXN101959, i mørk rød, ble overlagt med LHn / D, i cyan. Disulfidbroen mellom LC og Hn er uthevet i oransje. Zinkionen av SXN101959 er vist som en grå sfære. ( B ) Nærbildevisning av domenegrænseflaten i SXN101959 og LHn / D. Den C-terminale enden av LC og N-terminalen til Hn er merket. Plasseringen av målrettingsliganden er representert med den manglende delen av linkeren vist som en strekket linje. ( C ) Den synlige delen av linkerområdet i SXN101959 er uthevet med 2Fo-Fc- elektrondensitetskortet motsatt ved 1σ-nivå vist i blått. ( D ) Temperaturfaktor (B-faktor) analyse. Bånddiagram representasjon av LHn / D og SXN101959 strukturer, med en gradientfarging fra lave (cyan) til høye (røde) B-faktorer. Gradienter ble justert uavhengig for å markere det mindre bestilte området for hver struktur. ( E ) Aktivering av den humane GHRH-reseptoren . Reseptoraktivering ble detektert ved intracellulær akkumulering av cAMP i CHO-K1-hGHRH-R-celler inkubert med hGHRH (1-44) (•) eller SXN101959 (). Data er gjennomsnittlige ± som av tre eksemplarer fra ett eksperiment.

Full størrelse bilde

Struktur av SXN101959

SXN101959 er forskjellig fra LHn / D, og ​​fra naturlige BoNT-molekyler i linkerområdet mellom de to domenene. Den inneholder et Factor Xa klyvningssted, et GHRH ligand-domene (qGHRH [1-40]) og en GGGGS-gjentagelse (totalt ytterligere 56 rester). Det konstruerte protein ble krystallisert som et aktivert di-kjede molekyl og diffradert opp til 3, 1 Å oppløsning (Tabell 1). De asymmetriske enhetens to molekyler er generelt liknende (rmsd på 1, 05 Å over 828 Ca-atomer) og presenterer de samme uordnede regioner som korresponderer med 66 aminosyrer av linkerpeptidet (beskrevet ovenfor) og 17 rester av beltområdet. Begge disse områdene var heller ikke synlige i LHn / D (figur 5).

Selv om målingsliganden ikke kunne observeres, gir krystallstrukturen fortsatt verdifull informasjon om LHn / D som et rammeverk for proteinteknikk. Faktisk tilsetning av et stort peptidsegment ved LC-Hn-grensesnittet, hvilket er essensielt for BoNT-aktivitet 3, påvirket ikke LHn / D-stillaset (hvert molekyl overplaster til LHn / D med rmsd på 1, 08 (821 Ca) og 1, 40 Å ( 828 Ca-atomer), henholdsvis). De lette kjedene i SXN101959 og LHn / D er identiske, med liten variasjon i de løsningsmiddel tilgjengelige loopområder. Ingen merkbar forskjell ble sett i ryggraden på det aktive stedet (figur 5) til tross for at SXN101959 var katalytisk aktiv. Klar elektrondensitet ga bevis på sinkjonen på det katalytiske stedet, som er koordinert i henhold til det klassiske HEXXH-motivet. Det er overraskende at den mer merkbare forskjellen mellom SXN101959 og LHn / D ligger i translokasjonsdomenet hvor ekstremiteterne i spiral-spiralhjulene viser tegn på fleksibilitet, som bekrefter det som ble observert i LHn / D (figur 5).

Linkerregionen (residualene 438-513 i SXN101959) ble konstruert for å gi lett tilgang til målrettende GHRH ligand for dets reseptor. Den flankeres med et N-terminalt proteasespaltningssted som muliggjør aktivering av hele molekylet i dens kjedeform, og frigjør aminotiden av peptidkjeden. Den biologiske aktiviteten til GHRH blir beholdt av de 29 N-terminale aminosyrene for gjenkjenning av GHRH-reseptoren 30 . For å gi systemet mer strukturell fleksibilitet ble tre GGGGS-repetitive motiver inkludert på den C-terminale siden av peptidet. Dette tillater at målrettingspeptidet blir optimalt og sentralt presentert mens det forblir kovalent bundet til translokasjonsdomenet. Dette fleksible segmentet var forstyrret i krystallstrukturen. Den er plassert i et løsningsmiddel tilgjengelig område hvor det lett kunne bli innkvartert i krystallpakningen (tilleggsbilde). Det skal også legges merke til at den observerbare delen av linkeren, som består av LCs karboksyl- og Hn-aminoendene (henholdsvis 438-443 og 509-513), stabiliseres ved dannelsen av en anti-parallell β-ark konformasjon (Fig. . 5) slik at en av GGGGS-gjentakelsene er synlig. Målingspeptidet interagerer ikke med resten av molekylet, noe som er oppmuntrende fra et biologisk perspektiv, da det er avhengig av denne bevegelsesfriheten for å aktivere GHRH-reseptoren. SXN101959 er kjent for å aktivere GHRH-reseptor i rotte primære pituicytter som fører til internalisering og intracellulær spaltning av VAMP3 14 .

Integritet av prøven som ble brukt til strukturell studie ble testet ved å måle intracellulær akkumulering av det andre messenger-cAMP i humane GHRH-reseptor-uttrykkende celler. SXN101959 fremkalte en konsentrasjonsavhengig økning i cAMP-akkumulering med en pEC50 (potens) på 8, 73, sammenlignet med pEC50 av hGHRH (1-44) på ​​9, 54. Maksimal respons på SXN101959 var det samme som hGHRH (1-44), hvilket indikerer at TSI er en full agonist av hGHRH-reseptor. Aktivering av målreseptoren bekrefter tilstedeværelsen av qGHRH (1-40) liganden i strukturen av SXN101959 (figur 5E). Dermed fremhever krystallstrukturen til SXN101959 gyldigheten av LHn / D i sammenheng med en biologisk aktiv TSI.

Småvinkles røntgenspredningsstudier på LHn

Botulinum-nevrotoksinet har blitt grundig studert ved røntgenkrystallografi, men lite informasjon er tilgjengelig om relevansen av disse strukturene i løsning. Småvinkels røntgenspredning (SAXS) eksperimenter ble utført på LHn / A, / B og / D. Alle data ble samlet inn på stasjon X33 ved DESY (Tyskland) og oppløsningsspredningskurverne er gitt i figur 6A. De rensede prøvene var alle i deres aktiverte di-kjedeform.

( A ) Spredningskurven for LHn / A, / B og / D, fra venstre til høyre. ( Jeg er en relativ enhet, s er uttrykt i nm -1 ). ( B ) Den interatomiske avstandsfunksjonen ( P (r) ) ble beregnet (x akse, r i nm) med GNOM 43 (til venstre) og Guinier-plottet er presentert for hver prøve. ( C ) Ab initio løsning spredning modeller. SAXS perle modeller ble generert med DAMMIF 44 og i gjennomsnitt i DAMAVER 45 . Modellene er sammenlignet med prøvenees respektive røntgenkrystallstrukturer.

Full størrelse bilde

En Guinier-analyse av spredningskurverne var i samsvar med avstandsfordelingsfunksjonen ( P (r) ) ved bestemmelse av gyrasjonens radius ( Rg ) for hver LHn-serotype med verdier på ca. 32, 34 og 34 Å for A, B og D, henholdsvis (tabell 2, figur 6B). Interessant, deler LHn / B og / D også en tilsvarende maksimal dimensjon ( D max ) på 110 Å, litt lenger enn LHn / A ved 102 Å. De sammenlignbare egenskapene til de tre prøvene korrelerer med de kjente krystallstrukturer. De teoretiske spredningskurver ekstrapolert fra høyoppløsningsstrukturene ble beregnet med CRYSOL 31 og montert godt med eksperimentelle verdier (Tabell 2), selv om tilsvarende Rg var noe lavere enn de eksperimentelle segene (mellom 31 og 32 Å). Ab initio modeller ble generert fra spredningskurverne (figur 6C, tabell 2), og presenterer den generelle formen av LHn i løsning.

Full størrelse bord

Manuell docking tillot sammenligningen mellom ab initio perle modeller og krystallstrukturer. Den karakteristiske formen til de to domenene som danner LHn-molekylene, kan tydelig bemerkes i alle tre prøvene. Faktisk gir de atypiske lange spiral-spiralhjulene til translokasjonsdomenet modellene en utvidet form over 100 Å lang, mens den lette kjeden står for den kuleformede sentrale formen. I samsvar med statistisk sammenligning (Tabell 2) ser LHn / B ut til å vise den beste likheten mellom krystall- og løsningsstrukturer. De mindre dimensjonene av LHn / A i løsning kan være refleksjonen av den mer utprøvde sentrale kinken av dens translokasjonsdomene (figur 4). I tillegg presenterer LHn / D en mindre definert øvre region som kan være en indikasjon på domenebevegelse, med tanke på at perlemodellen representerer en gjennomsnittlig form for løsningsstaten. Interessant nok viste endringene i translokasjonsdomenet også tegn på mobilitet i krystallstrukturer av LHn / D og SXN101959.

Samlet sett viste informasjonen samlet for LHn / A, / B og / D at fragmentene har konservert LHn-brettet i løsningsstaten, selv om oppløsningen av dataene ikke tillater visualisering av små variasjoner.

Konklusjon

Botulinumneurotoksiner (BoNTs) er noen av de mest potente proteintoksinene, og deres modulære arkitektur har gjort dem molekyler av valg for utformingen av en ny klasse av biofarmaceutiske preparater merket Targeted Secretion Inhibitors. Den intracellulære aktiviteten til BoNT mot medlemmer av den løsbare N-etylmaleimid-følsomme faktor-bindingsproteinreceptorfamilien, et kritisk element i vesikulær sekresjon, kan omdirigeres mot bestemte celletyper. Dette konseptet bygger på funksjonaliteten til LHn-fragmentet som består av de katalytiske og translokasjonsdomenene til BoNT. De forskjellige, men variable egenskapene til hver serotype, som substratspecifikitet og virkningsvarighet, har ført til utvikling av skreddersydd TSI med optimal brukbarhet. Nylig rapport om den biologiske aktiviteten til SXN101959 ved inhibering av GH-sekresjon har vist betydningen av å bruke LHn / D som et rammeverk for proteinteknikk. Kristallstrukturen til LHn-fragmentet og SXN101959 presenterer for første gang egenskapene til de kombinerte translokasjon og katalytiske domener av BoNT / D. De oppgitte dataene har fremhevet plastikkheten til den lette kjeden og dens omfattende samhandling med translokasjonsdomenet. Translokasjonsdomenet fremstår som et "solidt stillas" som å bygge på en retargeting partner. Faktisk viste strukturen til SXN101959 at tilsetning av en lang peptidligand i en sentral posisjon ikke forårsaket noen signifikante strukturelle konformasjonsendringer, og dermed demonstrere robustheten av LHn strukturelle rammeverk og dets evne til å imøtekomme nye ordninger av domenenes underenheter, slik som sentrale presentasjon, innenfor TSI-proteiner. Endelig bekreftet løsningsspredningsanalysen strukturell integritet av LHn-fragmentet på tvers av serotyper. Samlet har denne studien gitt nyttig informasjon om strukturen til BoNT / D og LHn-fragmentet generelt, som vil være avgjørende for utviklingen av neste generasjon proteinbehandling basert på TSI-teknologien.

metoder

LHn / A, / B og / D kloning, ekspresjon og rensing

Kloning, ekspresjon og rensing ble utført ved å følge fremgangsmåter beskrevet tidligere 17, 18 . Kort fortalt ble LHn-konstruksjoner klonet i modifisert pET26b ekspresjonsvektor (Novagen, Madison, WI, USA) med en C-terminal 6 x His-tag og uttrykt i E. coli BL21 (DE3) celler. LHn-generene ble konstruert for å kode for et enterokinase- eller faktor Xa-spaltningssted mellom LC- og Hn-domenene. Proteiner ble renset ved affinitetskromatografi ved bruk av Ni2 + -ladet chelaterende sepharosekolonne (GE Healthcare, UK) og hydrofob interaksjon (Phenyl sepharose kolonne, GE Healthcare, UK). Prøver ble holdt i 0, 05 M HEPES pH 7, 2 med 0, 2 M NaCl.

LHn / D-konstruksjonen anvendt for røntgenkrystallografi korresponderer med den katalytisk inaktive LHn / D-dobbeltmutanten E230Q og H233Y. Standardsted-styrte mutagenese-teknikker som benytter PCR-amplifisering og påfølgende sekvensering ble anvendt for å lage den muterte DNA-konstruksjonen. I tillegg til mutasjonene som kreves for å eliminere katalytisk aktivitet, inneholder denne konstruksjonen et konstruert enterokinase klyvningssted mellom LC og Hn, men ble holdt som en enkeltkjedeprøve for krystallisering. Ekspresjon og rensing ble utført som for de andre LHn-prøvene beskrevet ovenfor.

SXN101959 forberedelse

Dette proteinet ble fremstilt som tidligere rapportert 15 . SXN101959 ble konstruert ved bruk av LC og Hn av BoNT / D (Entrez protein database tiltaksnummer P19321), et GHRH ligand domene, en bly sekvens spacer og et faktor Xa protease aktiveringssted lokalisert mellom de to domenene, som tidligere rapportert.

GHRH-reseptor-aktiveringsanalyse (cAMP-andre messengerakkumulering)

Frosne CHO-K1-celler som rekombinant uttrykker den humane GHRH-reseptoren, ble fortintet, oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i assaybuffer Hams F-12 (Life Technologies), 5 mM HEPES (Life Technologies), 1 mM 3-isobutyl-l- metylxanthin (IBMX, fra Calbiochem), 0, 05% BSA (Perkin Elmer), pH 7, 4). Cellususpensjon (5.000 celler godt 1) ble inkubert i hvite 384 brønnmikroplater i tre eksemplarer med økende konsentrasjoner av human GHRH (1-44, fra Bachem) (sluttkonsentrasjon 1 pM-100 nM) eller SXN101959 (10 pM-1 uM ), som hadde blitt serielt fortynnet i buffer. Plater ble inkubert ved 21 ± 3 ° C i 90 minutter. Etter ligandinkubering ble deteksjonsblanding (bestående av cellelysisbuffer, Lance Eu-W8044-merket streptavidin, cAMP-biotin og Alexa Fluor 647-anti-cAMP-antistoff) (kit fra Perkin Elmer) tilsatt til hver brønn. Plater ble inkubert ved romtemperatur i 24 timer, og fluorescensen som ble utgitt ved 665 og 615 nm etter eksitering ved 320 nm ble målt under anvendelse av en EnVision mikroplatteleser (PerkinElmer). Raw data was plotted as 615/665 nm emission ratio and converted to percentage of the maximum response (Emax) defined by hGHRH(1–44). Dose response curves were fitted using a variable slope model (using GraphPad Prism software) using equation (1).

where Y is the RFU, top and bottom are plateaus in the units of the Y axis, X is the log molar concentration and n H is the Hill slope. EC50 value is the negative log of the mid-point location of the curve.

X-ray crystallography

Crystals of LHn/D were grown with 2 μl of protein at 56 mg/ml mixed with 1 μl of reservoir solution consisting of 30% v/v pentaerythritol ethoxylate (15/4 EO/OH), 0.1 M HEPES 7.5, 6% w/v polyvinylpyrrolidone (MIDAS D2, Molecular Dimensions) and suspended above the well as a hanging drop. Crystals grew within 7–10 days into pear-like shapes of 50 to 500 μm in length.

SXN101959 crystals were grown from the sitting drop method against 0.1 M sodium actetate pH 5.5, 0.8 M sodium formate, 10% w/v polyethylene glycol 8000, 10% w/v polyethylene glycol 1000 (Clear Strategy Screen 1, B6, Molecular Dimensions). A drop of 200 nl of protein at 10 mg/ml was mixed with equal amount of reservoir and incubated at 16 °C.

Diffraction data were collected at station I03 of the Diamond Light Source (Oxon, UK), equipped with a PILATUS-6M detector (Dectris, Switzerland). A complete dataset to 2.3 Å and 3.1 Å were collected from single crystals at 100 K for LHn/D and SXN101959, respectively. Raw data images were processed and scaled with DIALS 32, and AIMLESS 33 using the CCP4 suite 6.5 34 . The resolution cut-off chosen was based on the CC 1/2 35 as adding weak high-resolution data beyond the commonly used limits recorded on the highly sensitive detector showed significant improvements in electron density maps. For LHn/D, initial molecular replacement was performed with the coordinates of LC/D (PDB code 2FPW 23 ) to determine initial phases for structure solution in PHASER 36 . The translocation domain was built in from a partial poly-alanine model of the secondary structures of LHn/B (PDB code 2XHL 18 ) and extended with BUCCANEER 37 . The refined LHn/D structure was then used for molecular replacement to solve SXN101959. The working models were refined using REFMAC5 38 and manually adjusted with COOT 39 . Water molecules were added at positions where Fo−Fc electron density peaks exceeded 3σ, and potential hydrogen bonds could be made. Validation was performed with MOLPROBITY 40 . Crystallographic data statistics are summarized in Table 1. All figures were drawn with PyMOL (Schrödinger, LLC, New York).

Small-angle X-ray scattering

Protein samples of LHn/A, LHn/B, and LHn/D were kept in 0.05 M HEPES 7.2, 0.2 M NaCl for SAXS analysis and checked for monodispersity by dynamic light scattering (Malvern Instruments). Samples were diluted to give three final concentrations at 5, 2.5 and 1 mg/ml. These dilutions were checked by absorbance measurement at 280 nm using a NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific), and concentration discrepancies were corrected for data analysis.

Solution scattering (SAXS) data for the three LHn molecules were collected at DESY, (Germany), EMBL Hamburg, beamline X33 41 . For each sample, a buffer measurement was performed before and after the sample at room temperature, using a PILATUS-1M (Dectris, Switzerland) detector. SAXS measurements were performed for each sample at three concentrations. Calibration was carried out with BSA at 5 mg/ml in 0.05 M HEPES pH 7.5 as a molecular weight standard. The data were processed and averaged with PRIMUS 42 followed by particle distance distribution function P(r) analysis using GNOM 43 . Data were further treated by using DAMMIF 44 to produce twenty ab initio models that were averaged with DAMAVER 45 .

Tilleggsinformasjon

How to cite this article : Masuyer, G. et al . Structural analysis of Clostridium botulinum neurotoxin type D as a platform for the development of targeted secretion inhibitors. Sci. Rep . 5, 13397; doi: 10.1038/srep13397 (2015).

Tilleggsinformasjon

PDF-filer

  1. 1.

    Tilleggsinformasjon

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens