Anonim

Temaer

  • DNA-bindende proteiner
  • Transkripsjonelle regulatoriske elementer

Abstrakt

Den generelle transkripsjonsfaktor IID (TFIID) er den første komponenten av preinitiasjonskomplekset (PIC) for å binde kjernepromotoren til RNA-polymerase II transkriberte gener. Til tross for sin kritiske rolle i proteinkodet genuttrykk, er hvordan TFIID engasjerer promotor-DNA forblir unnvikende. Vi har tidligere avslørt et DNA-bindingsdomen med vinger-helix i den N-terminale regionen av den største TFIID-underenheten, TAF1. Her rapporterer vi identifikasjonen av en andre DNA-bindende modul i den C-terminale halvdelen av menneskelig TAF1, som er kodet av et tidligere ukarakterisert konservert sinkknoke-domene. Vi viser at TAF1 zinkknuckle hjelpemidler i rekruttering av TFIID til endogene promotorer som er avgjørende for cellulær proliferasjon. Mutasjon av TAF1 sinkknekken med defekter i DNA-bindende kompromisser, promotorbelegg for TFIID, noe som fører til en reduksjon i transkripsjon og celle-levedyktighet. Sammen gir våre studier grunnlag for å forstå hvordan TAF1 spiller en sentral rolle i TFIID-promotorbinding og regulering av transkripsjonsinitiering.

Introduksjon

Dannelsen av preinitiasjonskomplekset (PIC) er en trinnvis prosess som kreves for eukaryot transkripsjon av proteinkodede gener 1, 2 . Den høyt orkestrert sammenstilling av de generelle transkripsjonsfaktorene (GTFs) TFIIA, B, D, E, F og H er ansvarlig for riktig posisjonering av RNA-polymerase II (RNAPII) ved kjernepromotorer og initiering av transkripsjon. TFIID nucleates PIC dannelse ved direkte binding til promotorsekvenser. TFIIA stabiliserer denne samspillet ytterligere, mens TFIIB-foreningen er fast etablert ved TFIIF / Pol II rekruttering, og TFIIE / TFIIH er avgjørende for promotor clearance 3, 4 .

TFIID er et multi-underenhetskompleks bestående av TATA-bindingsproteinet (TBP) og 14 TBP-assosierte faktorer (TAF'er) hos mennesker 5 . En liten delmengde av disse faktorene gjenkjenner spesifikke kjernepromotorelementer (CPEer) for å orientere PIC på transkripsjonsstartstedet 6, 7, 8 . TFIIDs evne til selektivitet å gjenkjenne promotorsekvenser ble først antatt å være i stor grad diktert ved TBP-binding til TATA-boksen 9 . Det primære beviset for denne modellen er at TBPs evne til å støtte et lavt transkripsjonsnivå mangler TAFs, hvis roller inkluderer å svare på transkriptionelle aktivatorer 10, 11 . Voksende bevis støtter ideen om at TBP alene ikke identifiserer genpromotorer, spesielt i høyere organismer 5, 11, 12 . Flertallet av humane proteinkoding-gener mangler en TATA-boksekvens, men TFIID er fortsatt i stand til å engasjere initiatoren og direkte transkripsjon fra TATA-mindre promotorer 13 . Derfor må andre PIC-komponenter være involvert i diktering av DNA-spesifisitet. En nylig studie viste at TAF-komponentene i TFIID er avgjørende for sekvensselektivitet, mens TBP alene viste ingen sekvenspreferanse 14 . Dette ekspanderer ved tidligere DNA-fotavtrykksanalyser som illustrerte en utvidet beskyttelsesområde ved TFIID sammenlignet med TBP, som ble tolket som TAFs-binding nær transkripsjonsstartstedet og nedstrømspromotorsekvensene 6, 15 .

Den spesifikke kombinasjonen av CPE varierer fra gen til gen, og deres unike arrangement kan bidra til at gener blir uttrykt til bestemte tider som svar på mobilbehov. De fleste av disse elementene er anerkjent av TAFs for å forbedre samspillet mellom TFIID og promotor DNA 2 . Initiatoren (Inr) er plassert på transkripsjonsstartstedet av over 40% av humane proteinkodende gener og er anriket ved TATA-mindre promotorer 16, 17 . Motiv-ti-element (MTE), nedstrøms promotorelement (DPE) og nedstrøms kjerneelement (DCE) er lokalisert nedstrøms for transkripsjonsstartstedet og antatt å bidra til promotorgenkjenning i fravær av en TATA-boks 2, 18, 19 . TAF1, den største underenheten av TFIID, har vist seg å forbinde med DCE, en diskontinuerlig sekvens funnet i virale promotorer så vel som det humane beta-globin-gen 19 . TAF1 interagerer også med Inr når det er komplisert med TAF2 6 . Selv om det er et vell av kunnskap om promotorsekvenser, er lite kjent om TAF / DNA-bindingsgrensesnitt og deres modus for interaksjon. Karakterisering av disse protein-DNA-interaksjonene vil fremme vår forståelse av hvordan hele TFIID-komplekset medierer transkripsjonsinitiering.

Vårt tidligere arbeid som beskriver en vingehjelm (WH) som ligger i det sentrale DUF3591-domenet, ga den første titt på TAF1s promotorgjenkjenningsegenskaper 20 . Når vår struktur av TAF1 DUF-domene bundet til TAF7 ble modellert i cryo-EM-strukturen av promotorbundet TFIID, bekreftet det at WH kan kontakte nedstrøms promotorsekvenser 21 . Cryo-EM-strukturen avslørte videre en liten sekundær tetthet av protein som kontaktet Inr, som forfatterne tilskriver TAF1. Fremskrittene i cryo-EM har gitt oss en generell ide om den generelle formen av TFIID og innsikt i de topologiske omarrangementene som følger med promotorbindende 21, 22 . Likevel er det nødvendig med ytterligere forbedringer for endelig å løse alle de avgjørende grensesnittene mellom TAF-underenhetene av TFIID- og kjernepromotor-sekvenser under den dynamiske strukturelle omorganisering fremkalt av promotorengasjement.

Tanken om at TAF1 inneholder flere DNA-bindende domener støttes av flere beviser. I tillegg til strukturelle data har TAF1 vist seg å binde to helt forskjellige og separate promotorelementer (dvs. Inr og DCE) som innebærer flere bindingsmoduler 6, 19 . DCE er en klynge av tre ikke-sammenhengende sekvenser. Hver ble vist å være viktig for transkripsjon og kan kryssbinde til TAF1; Den nåværende modellen antyder at TAF1 binder hele DCE, en region for stor til å være bundet av WH alene. Dessuten har gjær TAF1 blitt vist å inneholde en promotorbindende region nær sin C-terminus utenfor WH 23 . Denne regionen tilsvarer sekvens ved siden av det dobbelte bromodomain i den humane homolog, og gjær-TAF1 som mangler denne regionen var ikke i stand til å binde promotor-DNA. Flere DNA-bindende domener i TAF1 kan formidle plastisitet for å tillate anerkjennelse av forskjellige promotorsekvenser og tillate strukturelle omarrangementer under promotorengasjement.

Skjult mellom dobbeltbromodomain og DUF-domenet til TAF1, oppdaget vi en strengt konservert CCHC sinkknekke (ZnK) som spiller en viktig rolle i transkripsjonsregulering. Ved å undersøke menneskelig TAF1 ZnK-funksjon under både native og in vitro- forhold, identifiserte vi et andre tidligere ukarakterisert DNA-bindingsmodul i den største underenheten av TFIID. Vår undersøkelse viser at TAF1 ZnK er viktig for cellulær levedyktighet og bidrar til å lede TFIID til endogene kjernepromotorer gjennom DNA-bindingsevnen. Dette arbeidet etablerer et grunnlag for å dissekere kompleksiteten av TFIID-promotor anerkjennelse.

resultater

TAF1 inneholder et evolusjonært konservert sinkknokmotiv

TAF1 er et essensielt protein som finnes i alle eukaryotiske organismer. Bevaringen av TAF1 over disse kongedømmene betyr biologisk betydning. Ved å bruke sekvensinformasjon og kartleggingsregioner med høy bevaring, identifiserte vi deler av proteinet som ble selektivt opprettholdt gjennom hele utviklingen. En sekvensjustering utført på full lengde TAF1 ved å bruke åtte arter som spenner over det eukaryote rike avslørte to domener karakterisert ved strengt konserverte rester, som er fraværende i andre regioner av proteinet (figur 1A). DUF3591-domenet er den største bevaringsregionen. Spesielt, i ts13-mutantcellelinjen, har dette domenet en temperaturfølsom punktmutasjon (G716D) som forårsaker celler til cellecyklusarrest i sent G1 og til slutt gjennomgår apoptose 24, 25, 26 . Vi har tidligere preget strukturelementene i dette domenet med sin bindende partner TAF7 og oppdaget en vingehjelm (WH) 20 . Den andre regionen med streng bevaring sitter mellom DUF3591 og dobbeltbromodomain (2 × Bromo). Zooming inn på aminosyresekvensen i denne regionen avslører et uforanderlig Cx 2 Cx 4 Hx 6 C motiv (figur 1B). Bioinformatikk forutsier dette motivet som en formodet sinkknekke (ZnK), et felles bimolekylært interaksjonsdomene.

TAF1 inneholder en evolusjonært konservert sinkknok. ( A ) Linjær skjematisk fullverdig human TAF1 med prosentvis bevaring i eukaryoter vist. ( B ) Merket TAF1 zinkknoke bevaringsjustering spenner over vertebrater, insekter, nematoder, planter og sopp. Sinkknok cysteiner og histidin er bokset i blått. Konserverte positive rester som er indikert av de grønne prikkene. ( C ) Sequencejustering av sinkknok som inneholder proteiner fra eukaryoter og virus. ( D ) Justering av TAF1 ZnK-modellen (blå) fra I-TASSER prediksjonsanalyse med kjent struktur av ZnK av HIV-1 nukleokapsidprotein (grønt) og lin28 (lilla); ( E ) Elektrostatisk overflatekart av HIV-1 nukleokapsidproteinnukleinsyrebindingsoverflate (høyre) og tilsvarende region av TAF1 ZnK (venstre).

Full størrelse bilde

CCHC ZnK er et bredt forekommende domene som vanligvis finnes i nukleinsyrebindende proteiner 27, 28, 29 . En stor brøkdel av CCHC-domeneholdige proteiner, som kan justeres med TAF1 ZnK, er involvert i DNA-binding, noe som tyder på at TAF1 ZnK også kan interagere med DNA (figur 1C). I tillegg til sinkkoordinerende rester er flere andre aminosyrer vanlige for flertallet av CCHC-motiver: glycin etter den andre cystein, glycin som foregår histidin og prolin etter det tredje cysteinet. Den konsekvente plasseringen av disse restene antyder at de kan være viktige for riktig domenebfolding. Avstanden mellom de to første cysteinene og histidin er strengt konservert; Imidlertid kan avstanden mellom histidin og tredje cystein variere. Interessant, TAF1 deler samme avstand av to proteiner: I-faktor fra Drosophila og FAM90a hos mennesker 30, 31, 32 . I-faktor er et LINE-lignende transponeringselement og inneholder en ZnK i ORF1, som har vist seg å binde DNA 31 . FAM90 er en proteinfamilie funnet i primater, antatt å ha oppstått under flere dupliserings- og omarrangementshendelser 32 . ZnK i FAM90 har blitt foreslått å fungere som et DNA-bindende domene. Commonality av DNA som binder til denne tilsvarende spredte gruppen av sinkknokproteiner, antyder videre at TAF1 ZnK kan interagere med DNA.

En strukturell modell av TAF1 ZnK ble generert ved hjelp av I-TASSER 33 og viser en kompakt brett med CCHC-sidekjedene som peker mot midten, noe som muliggjør koordinering av en sinkion (figur 1D). Vår analyse anslått sannsynligheten for ligandbindende for CCHC å være over 90% basert på COACH-bindingsprediksjonen. Et strukturelt homologisøk identifiserte HIV-1 nukleokapsidprotein og lin-28 som topptreff. Begge proteiner er kjent for å interagere med nukleinsyre, og løsningsstrukturer av disse proteinene bundet til RNA er blitt løst 28, 34, 35 . En justering mellom disse strukturene avslører betydelige likheter i sinkkoordinerende rester, samt overlappende ladede rester (figur 1D). Oppladet overflateanalyse på ZnK av TAF1 identifiserte den ene siden av ZnK-brettet som er beriget med positivt ladede rester med positivt elektrostatisk potensial (figur 1E). Positive elektrostatiske patcher er et svært forutsigbart kjennetegn for DNA-bindingsproteiner. Videre viser denne ladede overflaten betydelig likhet med HIV-1-nukleinsyrebindingsoverflaten og inneholder to strengt konserverte positivt ladede aminosyrer som kan være kritiske for elektrostatiske interaksjoner (figur 1E). Disse utadvendte positivt ladede rester produserer et grensesnitt for antagelig å interagere med negativt ladede nukleinsyrer. Samlet sett betegner disse funksjonene TAF1 ZnK har potensial til å fungere som et DNA-bindingsdomene og dermed bidra til TFIID-promotoregenkjenning.

TAF1 sinkknokmotiv er avgjørende for cellens levedyktighet

Gitt den strenge bevaringen av TAF1 ZnK-domenet, spurte vi om det spiller en fysiologisk funksjon i celler. Vi brukte ts13-cellevariabilitetsanalysen for å avgjøre om ZnK-domenet er nødvendig for å utfylle den ts13 temperaturfølsomme G1- vekstfeilen . ts13- celler inneholder en betinget mutasjon i TAF1 og prolifererer ved den permissive temperaturen på 33, 5 ° C 24, 25 . Når skiftet til 39, 5 ° C, arrangerer cellene i sent G1 og gjennomgår apoptose, med mindre en funksjonell kopi av TAF1 eksogent uttrykkes 25, 36, 37 . Celler transfektert med wild-type TAF1 fortsetter gjennom cellesyklusen og prolifererer ved forhøyet temperatur. Omvendt resulterer ikke-funksjonell TAF1 i en reduksjon i antall levedyktige celler. Vi valgte å mutere de to første cysteinene i ZNK-domenet til TAF1 for å sikre at motivet ble fullstendig kompromittert. Endring av cysteinene til alaniner resulterte i en reduksjon på 60% i celle-levedyktighet, noe som indikerer en strukturelt intakt ZnK er avgjørende for full fysiologisk funksjon (figur 2A, B). Nivået på celleoverlevelse var sammenlignbart med punktmutasjoner i den tidligere karakteriserte TAF1-vingeformet helix (figur 2B). Videre hadde kombinasjon av ZnK- og WH-mutasjonene (3AZnM) en tendens til å ytterligere redusere cellelevbarheten sammenlignet med de enkelte mutanter, men nedgangen var ikke statistisk signifikant. Dette funnet kan tas for å antyde at begge domenene skal være fullt funksjonelle for riktig TAF1-aktivitet. Viktig er at alle TAF1-konstruksjoner ble uttrykt på ekvivalente nivåer i henhold til western blot-analyse, hvilket indikerer at mutasjonene ikke forårsaker proteininstabilitet (figur 2C).

TAF1 sinkknekke er nødvendig for celle-levedyktighet. ( A ) Fasekontrastbilder av ts13-celler transfektert med pCS2 + (vektor), wild type TAF1 (WT), winged-helix mutant (WH3A), sinkknokmutant inneholdende to cystein til alaninmutasjoner (ZnM) og dobbelt mutant (3AZnM ) ved 39, 5 ° C i 72 timer. ( B ) Kvantifisering av levedyktige DAPI-fargede celler (n = 3). Feilstenger representerer standardavvik. To-tailed analyse sammenlignet med vektor med 95% tillit, *** p <0, 0001 (Unpaired t-test). ( C ) Western blot av ts13 lysater som uttrykker HA-merkede TAF1 proteiner. Proteiner immunoprecipitert med TAF1-spesifikk dobbeltbromodomain-antistoff og immunoblottet for eksogent uttrykt TAF1 ved bruk av anti-HA-antistoff. Den fullstendige blottet er presentert i tilleggsbilde S4.

Full størrelse bilde

Sinkknok og vingehjelm av TAF1 er nødvendige for syklintgentransskripsjon

TAF1 er kjent for å være viktig for transkripsjon av celle syklusgenene cyclin A, D1 og E 36, 37, 38 . Feilingen av ZnM og WH3A for å komplementere vekstdefekten i ts13- celler indikerer at disse mutasjonene muligens kompromitterer en funksjon av TAF1 som er viktig for cyclin-genuttrykk. Vi fastslått at denne funksjonelle feilen ikke skyldes en manglende evne til å inkorporere i TFIID, men snarere en mangel i promotoregenkjenning. Vi bekreftet at TAF1-mutantene kan integreres i TFIID-komplekset ved å uttrykke hver TAF1-variant som et N-terminal HA-fusjonsprotein (HA-TAF1) ved å bruke et antistoff mot TAF4-underenheten for å immunpresipitere hele TFIID-komplekset og immunoblotting for eksogent uttrykte TAF1-varianter ved bruk av et anti-HA-antistoff. Tilstedeværelsen av andre TFIID-underenheter ble undersøkt ved western blotting (figur 3A) og sølvfarging (Supplemental Figure S5). Vi observerte at alle TAF1-varianter innlemmet i TFIID på relativt like nivåer sammenlignet med villtype-proteinet (figur 3A). I motsetning hevde TAF1-mutantene ikke med kjernepromotorer av cellecyklusgener i kromatinimmunpresipiteringsforsøk (figur 3B). For disse studiene ble forskjellige HA-TAF1-varianter uttrykt i HEK293-celler, og TAF1-bundet promotorfragmenter ble gjenvunnet og kvantifisert av qPCR. Syklin Dl og cyklin A2 ble valgt som målpromotorer fordi det riktige uttrykket av disse gener er nødvendig for cellecyklusprogresjon; deres promotorfunksjon har også vist seg å være avhengig av TAF1-aktivitet 37, 38, 39 . De spesifikke promotorregioner for qPCR-amplifikasjon ble valgt basert på ENCODE ChIP-data for TAF1. I tillegg er TAF1-promotor-binding betraktet som synonymt med kanonisk TFIID-binding, fordi TAF1 er unikt for TFIID mens andre TAF og TBP finnes i ekstra hjelpetransskripsjonskomplekskomplekser 2, 40 . Vi oppdaget at wild type TAF1 effektivt bundet til cyklin D1 og A2 promotorregioner, mens verken ZnM eller WH3A mutanten selektivt anriket for disse promotorfragmentene (figur 3B). Promoterforening av dobbeltmutanten (3AZnM) var ikke signifikant lavere enn enten enkeltdomenemutant. Den overgripende konklusjonen er at WH3A- og ZnM-mutanterne konsekvent binder mindre effektivt til syklinegener, og at begge domener kan bidra likt til TFIID-promotorgjenkjenning.

TAF1 sinkknok og vingehjelm er avgjørende for effektiv syklinpromotoraktivitet. ( A ) Inkorporering av TAF1 proteiner i TFIID. TFIID-kompleksene ble isolert ved immunutfelling og inkorporert HA-TAF1-varianter detektert ved anti-HA immunoblotting. Ytterligere TFIID-underenheter immunprecipitert ble påvist ved immunoblotting. Blomstene i full lengde er presentert i tilleggsbilde S5. Kvantitering av normaliserte HA-TAF1- og TAF-proteinnivåer er gitt i tilleggs tabell 2. ( B ) kromatinimmunutfelling av HA-TAF1-varianter uttrykt i HEK293-celler etterfulgt av qPCR for cyklin Dl og cyklin A2-promotorer (n = 4). ( C ) luciferase-analyse av cyklin Dl og cyklin A2-promotor-drevne reporterkonstruksjoner samtransfektert med TAF1-varianter. Luciferaseaktivitet ble normalisert for totalt protein og uttrykt i forhold til reporteraktivitet uten eksogen TAF1 (Tom), gitt en verdi på 1, 0 (n = 3). Alle feilfelt representerer standardavvik. To-tailed analyse sammenlignet med WT med 95% konfidens, ** p <0, 01, *** p <0, 0001 (unpaired t-test).

Full størrelse bilde

Deretter fastslått vi påvirkningen av promotoregenkjenning på transskripsjonsnivåer fra cyklin D1 og A2-promotorer. Ved å utnytte en luciferase-reporter-analyse, en konvensjonell metode for å studere genuttrykk, spurte vi om eksogent uttrykte TAF1-varianter påvirket syklinpromotorfunksjonen. Luciferasegenet ble plassert under kontrollen av den humane cyklin Dl- eller cyklin A2-promotoren. TAF1-varianter ble samtransfektert med hver luciferase-reporterkonstruksjon, og mengden luciferaseaktivitet, et mål for promotoraktivitet, ble vurdert ca. 36 timer etter transfeksjon. Reporteraktivitet i fravær av eksogent uttrykt TAF1 ble kvantifisert for å vurdere den endogene transkriptjonsaktiviteten til cyklinpromotorer. Dette signalet ble brukt til å normalisere på tvers av eksperimenter og fungerte som en kontroll som sikrer at transkripsjon ikke ble negativt påvirket ved å uttrykke en enkelt TFIID-underenhet. En nominell økning i TAF1 bør øke TFIID-dannelsen fordi TAF1 under normale forhold er i begrenset tilgang sammenlignet med andre TFIID-komponenter 41 . Faktisk økte ekspresjonen av wild type TAF1 signifikant nivået av luciferaseaktivitet fra begge promotorer sammenlignet med basale nivåer (figur 3C). I motsetning derved mislyktes TAF1 med mutasjoner til enten ZnK eller WH for å signifikant stimulere aktiviteten til cyklinpromotorer over bakgrunnsnivåer. Tilsvarende hadde dobbeltmutanten ingen effekt på syklinpromotoraktivitet (figur 3C). Det var derfor ingen statistisk forskjell mellom alle TAF1-mutanter og bakgrunnsnivåer. Vi undersøkte også effektene av WT og mutant TAF1-ekspresjon på transkripsjon fra den endogene cyklin Dl-promotoren i ts13 hamsterceller, som ble brukt til cellekomplementeringsanalysene. Vi observerte redusert stimulering av cyklin D1-transkripsjon av TAF1-domene-mutantene sammenlignet med WT TAF1 (Supplemental Figure S1). Samlet foreslår disse dataene ZnK og WH er kritiske for å rekruttere TFIID til kjernepromotorer og transkripsjonsinitiering.

TAF1 Zink Knuckle binder DNA

Strukturhomologi-modellering forutser at TAF1 ZnK potensielt interagerer med nukleinsyrer. Vi utførte elektroforetisk mobilitetsforskyvningsanalyser (EMSA) for å avgjøre om ZnK-domenet binder DNA. Proteinfragmentet anvendt i denne analysen inneholdt det merkede ZnK-domenet og flankerende regioner (ZnA, aa 1234-1375) for ikke å utelukke potensielle interagerende rester. Økende konsentrasjoner av ZnA-protein ble inkubert med tre forskjellige 32P-merkede dobbeltstrengede DNA-fragmenter, deretter utsatt for naturlig polyakrylamidgelelektroforese. Fragmentene representerer en optimalisert promotor inneholdende en Inr, MTE og DPE (IMD); en endogen promotor, cyklin D1 (CD1P); og en tilfeldig DNA-sekvens (tilfeldig). Vi observerte at TAF1 ZnA bundet til alle tre DNA-fragmenter (figur 4A-C). Vi fulgte opp denne analysen ved hjelp av en ortogonal teknikk, bio-lag interferometri (BLI), for en mer kvantitativ måling av bindingsaffinitet. Biotinylert dobbeltstrenget IMD, CD1P og tilfeldig oligonukleotider ble lastet på streptavidinprober og inkubert med forskjellige konsentrasjoner av ZnA-protein. Forening og dissosiasjonskinetikk ble overvåket i sanntid over to påfølgende 5 minutters perioder, henholdsvis (figur 4D-F). Dissosiering av proteinet fra sonden indikerte at proteiner ikke var irreversibelt aggregerende på DNA. På grunn av den observerte sakte hastigheten ble bindingsaffiniteter beregnet på grunnlag av steady state nivåer for hver proteinkonsentrasjon og involvert å plotte stabile bindingsnivåer mot proteinkonsentrasjon for hvert DNA. ZnA binder signifikant bedre til den optimerte promotor (IMD) og CD1P DNA (henholdsvis 288 nM ± 46 nM og 411 nM ± 101 nM) over tilfeldig DNA (1011 nM ± 228 nM). Disse data korrelerer med promotorstyrken til hvert fragment i luciferase-reporter-analyser, hvor IMD utviser den høyeste aktivitet etterfulgt av CD1-promotoren (Supplemental Figure S2). Interessant nok er nullkonstruksjonen som mangler en promotorsekvens, fortsatt i stand til å støtte lave nivåer av transkripsjon som indikerer at generelle transkripsjonsfaktorer er i stand til å binde og initiere transkripsjon fra tilfeldige sekvenser. Mangelen på sterk spesifisitet kan faktisk være et nødvendig trekk ved TAF1 gitt sekvensdiversiteten i Pol II-promotorer. Samlet gir disse studiene en mulig mekanisme for hvordan kompromittering av TAF1 ZnK fører til redusert transkripsjon.

TAF1 sink knoke binder DNA. ( A, B, C ) EMSA av TAF1 ZnA (aa 1234-1375) og tre radiomerkede DNA-fragmenter: IMD av superkjernepromotor (posisjon -6 til +38), cyklin Dl-promotor (posisjon -22 til +29, CD1P), og tilfeldig DNA-sekvens. ( D, E, F ) Biolag-interferometribindingskurver ved bruk av biotinylerte dobbeltstrengede DNA-fragmenter beskrevet ovenfor og de følgende ZnA-proteinkonsentrasjoner: 3 uM, 1 uM, 333 nM, 111 nM, 37 nM, 12 nM. Rå data ble plottet med GraphPAD Prism. Kd ble beregnet fra å plotte steady-state bindingsnivåer mot proteinkonsentrasjon.

Full størrelse bilde

Zink Knuckle er kritisk for DNA-binding

For å avgrense det minimale ZnK DNA-bindingsdomene ble TAF1 ZnA-protein inkubert med IMD DNA-fragment, og blandingen ble deretter eksponert for økende konsentrasjoner av subtilisinprotease. Fordøyelsesprodukter ble separert av SDS-PAGE, og mønsteret av proteinfragmenter sammenlignet med apo-ZnA-fordøyelsesmønsteret, generert i fravær av IMD-inkubasjon. Proteinregioner bundet til DNA ble beskyttet mot proteolytisk spaltning og ført til tre stabiliserte arter (figur 5A). Som forventet, ved høyere konsentrasjoner av protease, blir ZnA fullstendig nedbrytet, da DNA-binding er en dynamisk prosess, og DNAet er ikke i stand til å permanent beskytte proteinet mot enzymatisk nedbrytning. Kvantifisering av den relative intensiteten av de forskjellige proteolytiske produktene (Supplemental Figur S3) viste at konstruksjonen i full lengde (ZnA) var betydelig stabilisert sammen med to mindre fragmenter (ZnC og ZnD), som senere ble sekventert N-terminalt. Overraskende begynte fragment ZnC ved den samme aminosyren som det intakte ZnA-proteinet (aa 1234). Omdannelsen av ZnA til ZnC må derfor skyldes spaltning av C-terminalen. N-terminalen til ZnD-fragmentet ble kartlagt til aminosyre 1256, hvilket indikerer at N-terminal spaltning av ZnC resulterer i ZnD-produksjon. Interessant nok var ZnC minst stabilisert av IMD-promotoren, noe som tyder på at DNA-binding mer effektivt forhindrer spaltning av C-terminalen enn N-terminalen til ZnA-fragmentet.

Kjernemodul og nøkkelrester i TAF1 Zink Knuckle DNA Binding Domain. ( A ) TAF1 (aa 1234-1375) ble inkubert uten (øvre) og med (lavere) IMD-promotor-DNA etterfulgt av fordøyelse med økende konsentrasjoner av protease. Fordøyelsesprodukter ble løst ved SDS-PAGE og detektert ved coomassie-blå farging. Arrowheads indikerer fragmenter stabilisert av DNA. Kvantifisering av proteinfragmenter er gitt i supplerende figur S3. ( B ) EVfold kartanalyse av ZnA. Tall representerer aminosyrerester av full lengde TAF1. ( C ) Diagram over DNA-stabiliserte områder av TAF1 med blå boks som indikerer CCHC ZnK. DNA-bindingskurver for ( D ) ZnC-vildtype, ( E ) ZnC-cysteinmutant (C1285A og C1288A), ( F ) ZnC-ladningsmutant (R1295A og K1298A), ( G ) ZnD-villtype, ( H ) ZnD-cysteinmutant og ( I ) ZnD lade mutant. Rå data ble plottet med GraphPAD Prism. Kd ble beregnet ved å plotte steady-state bindingsnivåer mot proteinkonsentrasjon og bestemme konsentrasjonen som trengs for halv maksimal binding.

Full størrelse bilde

For å ytterligere definere TAF1 ZnK-domenet, analyserte vi ZnA-sekvens med EVfold, et program som minuter evolusjonær informasjon for å oppdage forbindelser mellom rester i et protein og forutsier en tredimensjonal form basert på samvarservering av aminosyrer 42 . Sterke forbindelser er gitt høye koblingspoeng og indikerer at restene har stor sannsynlighet for å eksistere i samme tredimensjonale rom. Plotting av forbindelsene illustrerer avstanden mellom samutviklede rester og identifiserer modulære domener innenfor proteiner. EVfold-analyse viste at ZnA-konstruksjonen inneholder to mindre underdomener: N-terminalen fra aa 1234-1313, som inneholder ZnK, og et C-terminalt domene som spenner over a1313-1375 (figur 5B). Det er veldig slående at den definerende grensen mellom disse to underdomene tilsvarer enden av gjær TAF1 homologen. En justering av sopp TAF1 proteiner avslører at sekvensbehandlingen slutter tre aminosyrer etter den siste zinkknoksysteinrest. Tilsammen kartleggte vi det potensielle, minimale ZnK bindingsdomene til å være aa 1256-1303 (ZnD) (figur 5C). Vi genererte deretter to konstruksjoner, ZnC (aa 1234-1303) og ZnD, og ​​renset disse proteinfragmentene, som ble ytterligere analysert ved BLI ved bruk av IMD-lastede prober (figur 5D, G). Kd-verdiene for ZnC (343 nM ± 42 nM) og ZnD (503 nM ± 67 nm) var lik den som ble oppnådd for ZnA, hvilket indikerer at ZnD representerer kjernedomenet for DNA-binding. Som forventet eliminert mutasjoner til de strengt konserverte cysteinene bindende (figur 5E, H). På grunn av mangel på merkbart signal over bakgrunnen, kan disse bindende dataene bare brukes til kvalitativ vurdering. Deretter søkte vi å bestemme rester som er kritiske for DNA-binding. Guidet av vår forventede strukturelle modell, muterte vi to positivt ladede rester mellom histidin og tredje cystein, som ligger på den ZnK-spådde DNA-bindingsoverflaten og konserveres over arter (se figur 1B, E). Konsistent med en kritisk rolle i bindende DNA, mutasjon av disse to positivt ladede rester enten i det vesentlige kompromitterte eller fullstendig opphevet DNA-bindingsaktiviteten av henholdsvis ZnC og ZnD (figur 5F, I). Den gjenværende DNA-bindingsaktiviteten til ZnC_RK-mutanten er mest sannsynlig tilskrevet flere ytterligere positivt ladede rester ved den N-terminale regionen i ZnC-fragmentet. Sammen viser disse forsøkene TAF1 ZnKs evne til å binde til DNA og kartlegge to ladede rester som er essensielle for denne aktiviteten. Identifikasjonen av en ytterligere DNA-bindingsmodul i menneskelig TAF1 innebærer at TFIID benytter en multi-level tilnærming til å engasjere DNA, og med denne kunnskapen vil vi fortsette å utvikle vår forståelse av promotorgjenkjenning og transkripsjonell initiering.

Diskusjon

CCHC sink knokler er kritiske fysiologiske domener og finnes over det biologiske spektret. De fleste ZnK'er er involvert i nukleotidbehandling, inkludert chaperoning, spleising, transkripsjonal aktivering og terminering 27, 28, 29 . ZnK funnet i TAF1 har en unik avstand delt av bare et lite antall annoterte ZnK proteiner, I-faktor og FAM90a, som begge er blitt notater som interaksjon med DNA 31, 32 . Gitt tilbøyelighet til sinkknokler til å binde DNA og TFIIDs rolle i transkripsjon, satte vi ut for å avgjøre om TAF1 ZnK interagerer med promotor-DNA. Vi fant at TAF1 ZnK kan binde til DNA med en affinitet som ligner på andre sinkknokler 43, 44 og identifiserte rester som er viktige for denne funksjonen. Sekvensens spesifisitet av ZnK, mens signifikant, er ikke absolutt. Dette speiler ChIP-seq-studier som ikke identifiserer noen sekvenser beriket av endogen TAF1. Denne data styrker våre funn som viser en marginell, men betydelig preferanse for promotor-DNA over en tilfeldig rekkefølge. TAF1 ZnK er fortsatt i stand til å binde random DNA med betydelig affinitet, 1 μM, noe som tyder på at ZnK kan binde med høy affinitet hos noen promotorer og lav affinitet hos andre. Dette kan også hevdes som en advarsel om bruk av et in vitro- system for å forstå kompleksiteten av fysiologiske forhold. Oppfølgingsforsøk som ChIP seq med mutante former for TAF1 kan bidra til å løse dette forbeholdet og identifisere noen sekvenser som fortrinnsvis binder et intakt ZnK-domene over WHD. På samme måte vil strukturelle studier definitivt etablere mekanismen for binding til DNA og kan brukes til å tydeligvis visualisere om protein / DNA-kontaktene kan tillate fleksibilitet i sekvensgjenkjenning.

Vi viser videre at TAF1 ZnK er viktig for cellulær levedyktighet. Mutasjoner i ZnK fører til en reduksjon i TFIID-forening med cyklin D1- og A2-promotorsekvenser, som vist ved en reduksjon i TAF1 ZnM-promotorbinding med ChIP og mangel på transkripsjonsstimulering i luciferase reporteraktivitetsanalyser sammenlignet med villtype TAF1. Oppdagelsen av en andre DNA-bindingsmodul i menneskelig TAF1 er et bemerkelsesverdig skritt fremover for vår forståelse av transkripsjonsinitiering. TAF1 DNA-bindingsaktivitet er et vitalt, men undersøkt aspekt ved transkripsjon. Videre utredning av TAF1s rolle i kjernepropreneerkjenning vil ha en dyp innvirkning på vår oppfatning av transkripsjonsregulering.

TFIID-promotor anerkjennelse er et viktig skritt i transkripsjonsregulering, men vi begynner bare å utrydde kompleksiteten i mekanismen. Våre data identifiserte et nytt konservert element i TAF1 som kan bidra til stabilisering av TFIID hos RNAPII-promotorer under PIC-dannelse. Det er flere mulige forklaringer på hvorfor TAF1 har utviklet flere DNA-bindende domener (DBDer). For det første kan flere kontaktpunkter hjelpe til med å danne en sikker forbindelse mellom TFIID og en tilsvarende promotor lenge nok til å rekruttere de andre viktige komponentene i transkripsjonsmaskinen. I tillegg kan flere DBDer gi TFIID den nødvendige fleksibiliteten til å knytte seg til en rekke kjernepromotor-sekvenser i hele det menneskelige genom, slik at anerkjennelse av forskjellige promotorer kan involvere forskjellige DNA-bindende domener. Sist men ikke minst, kan flere DBDer være viktige for den dynamiske omleggingen av TFIID, hvilke overganger fra konisk form til promotorbundet form, som demonstrert av Cryo-EM-studier 21, 22 . Ulike DNA-bindingsmoduler kan være nødvendige for å støtte denne bevegelsen, riktig orientere TFIID og laste GTFer på kjernepromotoren. Med disse mulighetene i bakhodet oppdager vi to modeller for hvordan TAF1 bidrar til TFIID-promotorgjenkjenning (figur 6). Enten simultan binding hvor WH og ZnK også bidrar til DNA-binding eller sekvensiell binding der et DNA-bindingsdomene går i inngrep i innledningsstrinnene etterfulgt av en andre DNA-bindingshendelse i den omorganiserte konformasjonen. Fremtidige studier ved hjelp av avanserte høyoppløselige teknikker vil være nødvendig for å avdekke detaljene i de unnvikende aspekter ved PIC-forsamlingen, da dagens synspunkter kan undervurdere kompleksiteten av TFIID-promotorgjenkjenning.

Modell av TAF1s rolle i promotor anerkjennelse. ( A ) ZnK og WH bind samtidig. ( B ) sekvensiell binding av ZnK og WH.

Full størrelse bilde

Syklinproteiner er master regulatorer av celle syklusen. Deres phasic uttrykk medierer enzymatiske aktiviteter som kreves for vekst og spredning 45 . Virkningen av TAF1 ZnK-mutasjonene på syklintransskripsjon skyldes ikke en manglende evne til å inkorporere i TFIID, noe som betyr at dette domenet ikke er involvert i TAF-interaksjoner eller kjernestrukturen til TAF1, begge viktige for TFIID-montering. Mens denne studien fokuserer på ZnKs evne til å binde nukleinsyrer, utelukker våre funn ikke muligheten for at ZnK kan interagere med andre regulatoriske proteiner. Nærheten til ZnK til den dobbelte bromodomain antyder at ZnK kunne spille en rolle for å lette anerkjennelsen av epigenetiske markeringer, noe som kunne påvirke promotorforeningen. Det er økende bevis på at sinkfinger kan spille en dobbel rolle: Støtter DNA-binding og letter proteininteraksjoner med histoner eller transkriptionelle aktivatorer, som de som finnes i CBP og ZYMND11 46, 47, 48, 49 . Vår eksperimentelle tilnærming kan imidlertid ikke utelukke denne muligheten med tanke på at våre transkripsjonsanalyser ble utført med luciferase-reporterplasmider som ikke er kjent for å innlemme histoner; Til tross for denne påstanden konkluderer vi at virkningen på syklintransskripsjon skyldes en defekt i aktiv PIC-formasjon, tilskrevet tap av promotorbinding av ZnK-mutanten inneholdende TFIID-kompleks. Manglende evne til å stimulere transkripsjon fra syklinpromotorer ville forklare hvorfor ZnK-mutanten ikke kan redde ts13-vekstdefekten i cellekomplementeringsanalysen.

Mekanismene som foreslås i dette arbeidet, kan også gi noe innsikt i patologiene til humane sykdomsstilstander assosiert med TAF1-mutasjoner av GWAS. CBioPortal og katalog over somatiske mutasjoner i kreft (COSMIC) databaser angir flere mutasjoner i de konserverte CCHC-rester av TAF1 inkludert: C1285R, C1288R, H1293N, C1300W / R. Selv om det er ukjent om disse mutasjonene er årsaksmessige, forsterker de tanken om at disse restene er avgjørende for riktig TAF1-funksjon i celler. TAF1 er avgjørende for cellens levedyktighet ved å slette genetisk dødelig til celler. Av denne grunn er det tvilsomt at sykdomsassosierte mutasjoner fullstendig fjerner TAF1-funksjonen og forårsaker global transkriptjonell dysfunksjon. Mer sannsynlig endres TAF1-funksjonen på en del subtil måte som resulterer i avvikende transkripsjon fra utvalgte gener. TFIIDs rolle i proliferasjon og celleoverlevelse gjør det av særlig interesse for kreftbiologi 50, 51.

Oppsummert oppdaget vi et andre kritisk DNA-bindende domene i TAF1, den største underenheten til TFIID generell transkripsjonsfaktor. Den konserverte sinkknekken er avgjørende for full in vivo- funksjon av TAF1. Mutasjoner i denne regionen forstyrrer ikke stabiliteten til TAF1 eller dens innlemmelse i TFIID, men i stedet forstyrrer sin evne til å knytte seg til kjernepromotorer. Tapet av promotorforeningen ville resultere i ineffektiv transkripsjonsinitiering. Vi spekulerer på at to motiver i TAF1 gir større fleksibilitet innen TFIID for promotor DNA sekvensgjenkjenning.

Materialer og metoder

ts13 Complementation Assay

Mammaliske TAF1 ekspressionsplasmider inneholder N-terminale HA-merkede humane TAF1-kodende sekvenser innført nedstrøms for CMV-promotoren i CS2 + vektor 52 . Punktmutasjoner i TAF1 ble introdusert ved stedrettet mutagenese og bekreftet ved DNA-sekvensering (Supplemental Table S1, 20). ts 13-celler ble dyrket ved 33, 5 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco) supplert med 10% føtalt bovinserum, 2 mM L-glutamin og penicillin / streptomycin. For komplementeringsanalyser ble celler podet i 6-brønnsplater, dyrket over natten til 70-80% konfluens og transfektert med 2 ug CS2 + eller TAF1 ekspressionsplasmider ved anvendelse av polyetylenimin (PEI) transfeksjonsreagens (forhold 2, 5: 1 PEI: DNA) i henhold til tidligere beskrevet protokoll 53 . Transfekterte celler ble opprettholdt i ytterligere 18-24 timer ved 33, 5 ° C, deretter enten høstet for Western Blot-analyse eller flyttet til ikke-oppløsende temperatur på 39, 5 ° C. Antall DAPI-positive levedyktige celler ble bestemt etter 36-48 timer ved 39, 5 ° C, og prosentandelen i forhold til WT-TAF1-transfekterte celler (gitt verdien av 100%) ble beregnet.


Luciferase Reporter Assay

Human cyclin Dl luciferase konstruksjon ble konstruert ved subkloning av EcoRI til PvuII fragmentet av pD1-G065 (vennlig fremskaffet av Yue Xiong) i Smal-stedet av pGL2-basisk som tidligere beskrevet 54 . Den humane cyklin A2 luciferase konstruksjon er blitt beskrevet 55 . IMD-luciferase-konstruksjonen er tidligere beskrevet i Juven-Gereshon et al . 56 og en gave fra J. Kadonaga. HEK293-celler ble dyrket ved 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco) tilsatt 10% føtalt bovinserum, 2 mM L-glutamin og penicillin / streptomycin. For luciferaseanalyser ble celler sådd i brønner med 24 brønner, dyrket over natten til 60% -70% konfluens og koptransfektert med 100 ng CS2 + eller TAF1 ekspresjonskonstruksjoner og 50 ng luciferase reporterkonstruksjon ved anvendelse av FuGene transfeksjonsreagens (forhold 2, 5: 1 av FuGene: DNA) i henhold til produsentens protokoll (Roche). Transfekterte celler ble opprettholdt ytterligere 36 timer ved 37 ° C, hvoretter celler ble høstet og lysert i 100 ul av 1 x passiv lysisbuffer (Promega). Luciferaseaktivitet ble målt i henhold til produsentens protokoll (Promega) på Lumat LB 9507 (Berthold Technologies) og normalisert for totalt protein. Transkripsjonsaktivitet ble uttrykt i forhold til CS2 + / reporterkonstruktransfekterte celler (satt til 1).


Cyclin D1 RT-qPCR

ts13-celler sådd i 35 mm fat ble dyrket ved 33, 5 ° C til 60-70% konfluens og transfektert med 500 ng CS2 + eller HA-TAF1 ekspressionsplasmider ved anvendelse av PEI (2, 5: 1 PEI: DNA-forhold). Totalt RNA ble isolert ca. 24-36 timer etter transfeksjon og 1 ug RNA reversert transkribert i cDNA ved bruk av iScript cDNA syntese kit (BioRad). Cyclin D1 transkripsjonsnivåer ble målt ved qPCR ved bruk av SsoFast EvaGreen Supermix (BioRad) på Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR-system. Relative transkripsjonsnivåer ble bestemt ved å beregne 2- AC .


Kromatinimmunutfelling

HEK 293-celler ble podet i 10 cm-retter og transfektert med CS2 + eller TAF1 ekspresjonskonstruksjoner og inkubert i 24-36 timer ved 37 ° C. Før høsting ble cellene tverrbundet med 400 ul 37% formaldehyd og analysert som tidligere beskrevet 57 . Kort sagt ble celler lysert i 0, 5 ml immunprecipitasjon (IP) buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100 og 0, 5% Nonidet P-40) som inneholdt proteaseinhibitorer og sonikeres 8 ganger i 20 s ved 40% amplitude (Branson Digital Sonifier). Kjernekstrakt ble inkubert natten over ved 4 ° C med enten anti-HA (klon 3F10, Sigma Aldrich) eller mus IgG (Abcam). Immunprecipiterte komplekser ble vasket og eluert. Kryssbindinger ble reversert og DNA ble isolert. Inndata-DNA ble renset fra 100 ul ekstrakt. Femti nanogram inngangsd DNA og 2 μl renset TAF1-bundet DNA ble amplifisert med SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) ved bruk av primere som spenner over promotorene av cyklin D1 og cyklin A2 (Supplemental Table S1). Kvantitativ PCR ble utført på Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR-systemet og dataene uttrykt som prosentinngang.


TFIID og TAF1 immunpresipitasjon

For fremstilling av nukleære ekstrakter ble HEK293-celler resuspendert i buffer A (10 mM HEPES, pH 7, 9, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0, 5 mM DTT) og inkubert på is i 15 minutter. Celler ble lysert ved å skyve gjennom en 25 gauge nål 5 ganger. Den urene atomkjernen ble isolert ved sentrifugering i 20 s ved 12 000 g, resuspendert i buffer C (20 mM HEPES, pH 7, 9, 25% glyserol, 420 mM NaCl, 1, 5 mM MgCl2, 0, 2 mM EDTA, 0, 5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0, 5 mM DTT) og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering i 5 minutter ved 12.000 g ble supernatanten / kjerneekstraktet inkubert med anti-TAF4 (mAb 3A6, ref. 58 ) eller anti-HA-antistoff natten over ved 4 ° C. Ti mikroliter protein A-Sepharose CL-4B (GE Healthcare) ble tilsatt, og prøvene ble blandet i 2 timer ved 4 ° C. Isolerte proteiner ble vasket 5 ganger med buffer C og analysert ved sølvfarging eller immunblotting ved bruk av antistoffer mot HA (klon 3F10, Sigma Aldrich), TAF1 bromodomain (Ab1230, ref. 59 ), TBP (gave fra R. Tjian, ref. 5 ), TAF4 (mAb 3A6) og TAF5 (mAb 6C1, upubliserte data).


Proteinrensing

For ekspresjon av His-merkede TAF1-proteiner ble cDNA fra TAF1 (ZnA-1234-1371, ZnC-1234-1303, ZnD-1256-1303) PCR amplifisert fra CS2 + inneholdende full lengde TAF1 og klonet inn i pAL-GB1 ved bruk av ligase-uavhengig kloning; site-directed mutagenese ble brukt til å introdusere punktmutasjoner i ZnC- og ZnD-konstruksjoner (Supplemental Table S1). TAF1 ZnK-uttrykkskonstruksjoner ble transformert til BL21 * -celler for proteinekspresjon. Begynnerkulturer på 10 ml ble fortynnet i 1 L LB inneholdende 30 ug / ml kloramfenikol, og celler ble dyrket til en optisk tetthet på 0, 8-1, 0 ved 600 nm og avkjølt på is i 1 time. TAF1-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av 0, 2 mM IPTG (isopropyl-D-tiogalaktopyranosid) i 18 timer ved 16 ° C. Celler ble høstet ved sentrifugering og lysert ved puls-sonikering i 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 300 mM NaCl, 5 mM imidazol, 5% glyserol, 0, 05% Triton-X, 1 mM DTT tilsatt proteaseinhibitorer. His-GB1-TAF1 ble renset ved å bruke Ni-nitrilotrieddiksyre (NTA) agarose (Qiagen), vasket med buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 5% glyserol, 1 mM DTT ), etterfulgt av høyt saltvask (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 1 M NaCl, 5% glyserol, 1 mM DTT) og en sluttvask med buffer A. Protein ble eluert med 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0, 150 mM NaCl, 200 mM imidazol, 5% glycerol, 1 mM DTT. For proteolytiske fordøyelses- og elektroforetiske mobilitetsforskyvningsanalyser ble ZnA videre renset ved kationutveksling (GE Healthcare) etter spalting av spaltning av tobakksete (TEV) protease. Proteiner for biolag-interferometri ble ytterligere renset ved størrelseseksklusjonskromatografi (GE Healthcare) ved bruk av 10 mM HEPES, pH 7, 9, 150 mM NaCl, 1 mM DTT.


Elektroforetisk Mobility Shift Assay

Renset TAF1 (ZnA-1234-1371) (7, 6-61, 3 pmol) renset fra E. coli ble inkubert med 4 ng 32 P 5'-ende merket DNA i 10 mM HEPES pH 7, 9, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM tetranatriumpyrofosfat, 0, 2 mM di: dC i 1 time ved 25 ° C. For gelelektroforese ble 6 x påføringsbuffer (20% Ficoll, 0, 025% bromfenolblått) tilsatt, og bindingsreaksjoner ble lastet på nondenserende 5% polyakrylamid (37, 5: 1 akrylamid: bis) forhåndsforsøk i 0, 5 x TBE ved 100 V for 30 min. Prøver ble løst i 1, 5 timer ved 100 V og skiftede komplekser påvist ved autoradiografi. Sekvensene av DNA som brukes for EMSA er gitt i tilleggstabell S1.


Biolayer Interferometry

5'-biotinylerte oligonukleotider ble annealed til deres komplement (IDT, USA) i 1 x bindingsbuffer (10 mM HEPES pH 7, 9, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT) ved oppvarming ved 72 ° C i 5 minutter og sakte avkjøling til 25 ° C. Dobbeltstrengede oligoer (tilleggstabell S1) ble renset ved ekstraksjon fra agarose etter gelelektroforese og deretter utfelt etanol. Rensede biotinylerte dobbeltstrengede oligos ble lastet på streptavidin-belagte (SA) sensorer, og interaksjonene mellom de DNA-belagte probene og TAF1-proteiner ble målt ved hjelp av ForteBio Octet RED96-systemet (Pall Life Sciences). For lasting ble SA sensorer forhåndsinnstilt i analysebuffer (10 mM HEPES pH 7, 9, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 0, 1% ovalbumin, 0, 2 mM di: dC) i 30 minutter, så dyppet i individuelle brønner på 96 brønnplater (200 pl / brønn) inneholdende biotinylert DNA (100 nM) i analysebuffer. Ubundet DNA ble fjernet ved vasking og eksponering av streptavidin blokkert med biocytin. Protein ble fortynnet i analysebuffer til 3 uM, 1 uM, 333 nm 111 nm, 37 nm og 12 nm. Forbindelsen av proteinet til sonden ble observert i 300 s etterfulgt av dissosiasjon i analysebuffer i 300 s. Throughout loading, association and dissociation sensors were shaking (1, 000 rpm) at a constant 30 °C to promote specific interaction and to reduce non-specific binding. A reference sensor (no biotinylated DNA loaded) was included and subjected to the same procedure to control for non-specific interactions. Sensors were regenerated (10 mM HEPES pH 7.9, 1 M NaCl) between experiments and a new baseline established. Reference-subtracted data was used to calculate the equilibrium dissociation constant (K d ) by steady-state response analysis assuming 1:1 kinetics.


DNA Protection Assay

TAF1 (aa 1234–1371) was exposed to limited proteolytic digestion in the presence and absence of DNA (IMD) to determine DNA-bound stabilized regions. TAF1 (625 pmol) was incubated with or without DNA (700 pmol) in 10 mM HEPES pH 7.9, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 20 mM tetrasodium pyrophosphate, 0.2 mM dI:dC) for 1 h at 25 °C. Subtilisin (0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, and 0.6 μg/ml) was added to each sample and incubated overnight on ice at 4 °C. Samples were divided in two and analyzed as follows: SDS-PAGE, coomassie stained, and scanned for analysis; SDS-PAGE, transferred to PVDF membrane, coomassie stained and stabilized fragments excised and N-terminally sequenced.


Datatilgjengelighet

Alle data som er generert eller analysert i løpet av denne studien er inkludert i denne publiserte artikkelen (og dess tilleggsinformasjon).

bekreftelser

We thank the Hague and Scott laboratories in the Department of Pharmacology at the University of Washington for the use of reagents and instruments, L Cheng for assistance with the in vivo complementation experiments, and members of the Zheng and Wang laboratories for discussion. This study was supported by PHS NRSA T32GM007270 from NIGMS (to ECC), Howard Hughes Medical Institute (to NZ) and University of Washington Royalty Research Fund (to EHW).

Elektronisk tilleggsmateriale

  1. Supplerende figurer og tabell

kommentarer

Ved å sende inn en kommentar, godtar du å overholde våre vilkår og retningslinjer for fellesskapet. Hvis du finner noe fornærmende eller som ikke overholder våre vilkår eller retningslinjer, merk det som upassende.

Anbefalt Redaksjonens